Engineering microbial cell factories: Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum with a focus on non-natural products
- 作者
- Sabine A. E. Heider, Volker F. Wendisch
- 单位
- Chair of Genetics or Prokaryotes, Faculty of Biology & CeBiTec, Bielefeld University, Germany
- 杂志
- Biotechnology Journal（2015）
- DOI
- 10.1002/biot.201400590
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何利用合成生物学方法拓展谷氨酸棒杆菌的底物利用范围并生产非天然产品，同时开发适用于工业生产的底盘菌株。
研究策略
综述了基于代谢物传感器的经典菌株选育、合成途径嵌入中心代谢（如戊糖利用、非天然产品合成）、以及底盘工程（生物素原养型、基因组精简）等策略。
研究路线图
核心内容
该综述系统总结了利用合成生物学工具改造谷氨酸棒杆菌、拓展其底物利用范围并生产非天然产品的策略与进展。作者围绕经典菌株选育、合成途径嵌入中心代谢以及底盘工程三条主线展开，重点介绍了戊糖利用、非天然产品合成途径的构建，以及生物素原养型和基因组精简型底盘菌株的开发。通过代谢物传感器辅助筛选和调控关键基因，研究者实现了多种非天然产品的高效生产：GABA最高产量约39 g/L，L-脯氨酸产量约13 g/L且产率达0.36 g/g葡萄糖，腐胺在删除snaA基因后产率提高约41%至0.26 g/g，异丁醇在连续萃取后产量可达981 mM，类胡萝卜素平台菌株产量达3–4 mg/g细胞干重。此外，基因组精简菌株MB001删除了约6%的基因组序列，进一步删除36个非必需簇预计可再减少22%。这些结果表明，合成生物学策略已能有效推动谷氨酸棒杆菌从传统氨基酸生产菌向多功能细胞工厂转变，但相关底盘菌株的工业规模适用性仍需进一步验证与优化。
创新点
将合成生物学工具应用于谷氨酸棒杆菌，实现非天然产品如异丁醇、类胡萝卜素、萜烯等的生产，并开发了生物素原养型及基因组精简的底盘菌株。
研究对象（22）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Corynebacterium glutamicum | L-谷氨酸代谢 | pknG | 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G | 调控 | 敲除提高胞内谷氨酸浓度，促进GABA生产 |
| Corynebacterium glutamicum | GABA合成 | gad | 谷氨酸脱羧酶 | 催化 | 异源表达来自E. coli或乳酸菌的谷氨酸脱羧酶基因 |
| Corynebacterium glutamicum | L-脯氨酸合成 | ocd | 鸟氨酸环化脱氨酶 | 催化 | 来自Pseudomonas putida，异源表达 |
| Corynebacterium glutamicum | 腐胺合成 | speC | 鸟氨酸脱羧酶 | 催化 | 来自E. coli，异源表达 |
| Corynebacterium glutamicum | 腐胺乙酰化 | snaA | N-乙酰转移酶SnaA | 催化 | 敲除避免N-乙酰腐胺形成，腐胺产率提高41% |
| Corynebacterium glutamicum | 精氨酸生物合成 | argR | 精氨酸阻遏蛋白 | 调控 | 敲除解除精氨酸生物合成阻遏 |
| Corynebacterium glutamicum | 精氨酸生物合成 | argG | 精氨基琥珀酸合成酶 | 催化 | 敲除阻断瓜氨酸转化为精氨酸 |
| Corynebacterium glutamicum | L-瓜氨酸合成 | argF | 鸟氨酸氨甲酰转移酶 | 催化 | 过表达促进瓜氨酸积累 |
| Corynebacterium glutamicum | 2-酮异戊酸合成 | ilvE | 支链氨基酸转氨酶 | 催化 | 敲除以阻断缬氨酸合成，增强KIV积累 |
| Corynebacterium glutamicum | 异丁醇合成 | kivD | 酮酸脱羧酶 | 催化 | 来自Lactococcus lactis，异源表达 |
| Corynebacterium glutamicum | NADH/NADPH转换 | pntAB | 转氢酶 | 能量供给 | 来自E. coli，异源表达以提供还原力 |
| Corynebacterium glutamicum | 异丁醇合成 | adhA | 醇脱氢酶 | 催化 | 过表达内源adhA |
| Corynebacterium glutamicum | 类胡萝卜素合成 | crtE, crtB, crtI | GGPP合酶、八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 过表达人工操纵子增强类胡萝卜素通量 |
| Corynebacterium glutamicum | C50类胡萝卜素合成 | crtY, crtEb, crtX | 番茄红素环化酶、胡萝卜素葡萄糖基转移酶 | 催化 | 平台菌株LYC1中异源表达不同来源基因生产不同类胡萝卜素 |
| Corynebacterium glutamicum | 缬烯合成 | valencene synthase | (+)-缬烯合酶 | 催化 | 来自Citrus sinensis或Nootka cypress，异源表达 |
| Corynebacterium glutamicum | 异戊二烯前体供应 | idsA, crtE | GGPP合酶 | 催化 | 敲除后异源表达FPP合酶以积累FPP |
| Corynebacterium glutamicum | 蒎烯合成 | pinene synthase | 蒎烯合酶 | 催化 | 来自Abies grandis，与GPP合酶共表达 |
| Corynebacterium glutamicum | MEP途径 | dxs, idi | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶、异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 过表达增强IPP前体供应 |
| Corynebacterium glutamicum | 生物素生物合成 | bioWAFDBI | 生物素合成酶系 | 催化 | 来自Bacillus subtilis，异源表达实现生物素原养型 |
| Corynebacterium glutamicum | 腐胺转运 | cgmA | CgmA转运蛋白 | 转运 | 过表达增加腐胺分泌 |
| Corynebacterium glutamicum | 腐胺调控 | cgmR | 转录阻遏蛋白CgmR | 调控 | 响应腐胺浓度调节cgmRA表达 |
| Corynebacterium glutamicum | 支链氨基酸输出 | brnFE | BrnFE输出系统 | 转运 | 用于Lrp生物传感器检测支链氨基酸 |
关键发现
- GABA最高产量约39 g/L
- L-脯氨酸产量约13 g/L，产率0.36 g/g葡萄糖
- 腐胺最高产率约0.26 g/g，删除snaA使腐胺产率提高约41%
- L-瓜氨酸产量约44 mM，产率0.38±0.01 g/g，体积生产力0.32±0.01 g/L/h
- 2-酮异戊酸产量达188 mM（约22 g/L）
- 异丁醇厌氧两相发酵产量达175 mM，连续萃取后可达981 mM
- 类胡萝卜素平台菌株产量达3-4 mg/g DW
- 缬烯产量最高0.25±0.03 mg/g DW
- 蒎烯产量约0.027±0.007 mg/g DW
- MB001基因组精简6%，进一步删除36个非必需簇预计减少22%。
研究结论
合成生物学方法已成功应用于谷氨酸棒杆菌，使其能够利用多种替代碳源并生产多种非天然产品，同时通过生物素原养型和基因组精简优化了底盘菌株，但工业规模应用仍需进一步评估。