Redirection of Flux Through the FPP Branch-Point in Saccharomyces cerevisiae by Down-Regulating Squalene Synthase
- 作者
- Eric M. Paradise, James Kirby, Rossana Chan, Jay D. Keasling
- 单位
- Department of Chemical Engineering, University of California, Berkeley, California 94720; California Institute for Quantitative Biomedical Research (QB3), University of California, Berkeley, California 94720; Department of Bioengineering, University of California, Berkeley, California 94720; Synthetic Biology Department, Physical Bioscience Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, California 94720; Berkeley Center for Synthetic Biology, University of California, 717 Potter Street, Building 977, Mail Code 3224, Berkeley, California 94720-3224
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2008）
- DOI
- 10.1002/bit.21766
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
通过下调鲨烯合酶基因ERG9，将酿酒酵母中FPP分支点的代谢流向从甾醇合成转向异源倍半萜（紫穗槐二烯）的生产，以提高青蒿素前体产量。
研究策略
采用甲硫氨酸可阻遏的MET3启动子替换ERG9天然启动子，实现对鲨烯合酶表达的可调性下调；结合过表达截短HMG-CoA还原酶(tHMGR)和转录因子upc2-1增强甲羟戊酸途径通量；通过比较不同培养条件（混合碳源与纯半乳糖）和不同甲硫氨酸浓度，研究ERG9抑制水平与时机对紫穗槐二烯产量的影响。
核心内容
本研究通过将酿酒酵母中鲨烯合酶基因ERG9的天然启动子替换为甲硫氨酸可阻遏的MET3启动子，实现FPP分支点代谢流向的可调性下调，从而将碳通量从甾醇合成转向异源倍半萜紫穗槐二烯的生产。在仅表达紫穗槐二烯合酶（ADS）的菌株基础上，逐步引入截短HMG-CoA还原酶（tHMGR）和转录因子upc2-1增强甲羟戊酸途径通量，并系统比较了混合碳源与纯半乳糖培养条件及不同甲硫氨酸浓度的影响。结果显示，在混合碳源添加1 mM甲硫氨酸条件下，仅引入MET3启动子调控ERG9的菌株产量达5 mg/L/OD600，较对照提高5倍；进一步过表达tHMGR和upc2-1后产量分别提升至15和24 mg/L/OD600。纯半乳糖培养时ERG9抑制效果更显著，最高产量提升达5.6倍；而混合碳源中0.2 mM甲硫氨酸为最优条件，过高浓度反而降低产量。下调ERG9同时导致角鲨烯和麦固醇含量下降。该研究首次实现了ERG9表达的可调性精细控制，揭示了抑制时机与培养条件对FPP分流效率的关键影响，为酵母中异源萜类化合物的高效生产提供了策略参考。
创新点
首次使用MET3启动子对ERG9进行可调性下调，实现FPP流向的精细调控；揭示了ERG9抑制的时序相对于ADS诱导和甲羟戊酸途径基因表达的时机对产物产量的关键影响。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 甾醇生物合成 | ERG9 | 鲨烯合酶 (Squalene synthase) | 催化 | 启动子被替换为MET3启动子，实现甲硫氨酸可阻遏的下调表达 |
| EPY201 (BY4742 pRS425ADS) | 倍半萜合成 | ADS | 紫穗槐二烯合酶 (Amorphadiene synthase) | 催化 | 异源表达，将FPP转化为紫穗槐二烯 |
| EPY225 (EPY226 P_GAL1-tHMGR) | 甲羟戊酸途径 | tHMGR | 截短的HMG-CoA还原酶催化域 | 催化 | 过表达以增强FPP合成 |
| EPY213 (EPY225 P_GAL1-upc2-1) | 甾醇生物合成调控 | upc2-1 | UPC2突变体转录因子 | 调控 | 增强甾醇合成基因及部分甲羟戊酸途径基因表达 |
| EPY224 (EPY213 P_GAL1-tHMGR P_GAL1-ERG20) | 甲羟戊酸途径 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶 (FPP合酶) | 催化 | 额外拷贝过表达，在本文中未进行生产测试 |
关键发现
- 在混合碳源（0.2%葡萄糖+1.8%半乳糖）、1 mM甲硫氨酸条件下，EPY201（仅ADS）产紫穗槐二烯1 mg/L/OD600
- 引入P_MET3-ERG9后EPY226产量为5 mg/L/OD600（5倍提高）
- 再加tHMGR后EPY225产量达15 mg/L/OD600
- 再加upc2-1后EPY213产量为24 mg/L/OD600。在混合碳源中，添加1 mM甲硫氨酸使EPY226产量提高2.3倍，EPY225提高4.1倍，EPY213仅提高50%。在纯半乳糖培养基中，添加甲硫氨酸使EPY226产量提高5.6倍，EPY225提高4.6倍，EPY213提高5倍。在EPY213中，纯半乳糖培养时，甲硫氨酸浓度≥0.2 mM时产量达到最大值，比无甲硫氨酸提高3.3倍
- 混合碳源培养时，0.2 mM甲硫氨酸产量最高，比无甲硫氨酸提高1.7倍。高甲硫氨酸（≥0.3 mM）下细胞密度最多下降15%。随着ERG9抑制增强，角鲨烯和麦角固醇含量均下降。
研究结论
通过MET3启动子下调ERG9可有效将FPP从甾醇合成转向紫穗槐二烯，但需优化抑制水平与时机。在纯半乳糖培养中ERG9抑制效果最显著，最高达5.6倍提升；混合碳源培养时，0.2 mM甲硫氨酸达到最优，过高浓度反而降低产量。下调ERG9同时导致角鲨烯和麦角固醇含量下降。