Production of Plant Sesquiterpenes in Saccharomyces cerevisiae: Effect of ERG9 Repression on Sesquiterpene Biosynthesis
- 作者
- Mohammad A. Asadollahi, Jérôme Maury, Kasper Møller, Kristian Fog Nielsen, Michel Schalk, Anthony Clark, Jens Nielsen
- 单位
- Center for Microbial Biotechnology, BioCentrum-DTU, Technical University of Denmark, Building 223, DK-2800 Kgs. Lyngby, Denmark; Firmenich SA, Corporate R&D Division, Geneva, Switzerland
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2008）
- DOI
- 10.1002/bit.21581
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在酿酒酵母中高效异源生产植物倍半萜（valencene、cubebol和patchoulol），面临异源合成酶表达、前体FPP供应不足以及产物挥发和低溶解度导致定量困难等挑战。
研究策略
利用酿酒酵母甲羟戊酸途径，通过将ERG9天然启动子替换为可调控的MET3启动子并在培养基中添加2 mM甲硫氨酸下调ERG9表达，从而减少FPP向角鲨烯的流向，增加FPP前体供应；同时采用十二烷作为第二相的两相发酵实现倍半萜的原位分离和定量；并通过在发酵过程中补充甲硫氨酸维持ERG9抑制。
核心内容
本研究在酿酒酵母中异源生产植物倍半萜（瓦伦烯、古巴烯和广藿香醇），通过将ERG9天然启动子替换为可调控的MET3启动子，在培养基中添加2 mM甲硫氨酸下调角鲨烯合酶表达，减少FPP向甾醇分支的流向来增加前体供应。同时采用十二烷作为第二相的两相发酵实现挥发性产物的原位捕获与定量，并系统比较了启动子和碳源的影响。结果显示，ERG9抑制使麦角固醇含量从18.75降至3.31 mg/g DW，但FPP主要分流至法尼醇而非目标倍半萜，表明合成酶活性是产量限制因素。表达广藿香醇合成酶的菌株产生patchoulol 6.7 mg/L，总倍半萜18.1 mg/L，产量为1.21 mg/g DW；在发酵中补充更高浓度甲硫氨酸后，patchoulol和法尼醇终滴度分别提高47%和82%。研究证实动态下调ERG9结合两相发酵可有效改善倍半萜生产，酿酒酵母具备作为倍半萜细胞工厂的潜力，后续需进一步优化异源合成酶表达以提升目标产物占比。
创新点
首次在酿酒酵母中异源表达古巴烯（cubebol）合成酶；开发两相发酵系统有效捕获挥发性倍半萜；通过动态调节甲硫氨酸浓度进一步改善倍半萜产量；系统比较了不同启动子和碳源对生产的影响。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | ERG9 | 角鲨烯合酶 | 催化 | 编码角鲨烯合酶，催化FPP转化为角鲨烯；通过将天然启动子替换为MET3启动子并添加甲硫氨酸进行下调 |
| Saccharomyces cerevisiae | 倍半萜生物合成 | GFTpsD | 瓦伦烯合成酶 | 催化 | 来源于葡萄柚，催化FPP生成瓦伦烯，在GAL1或TPI1启动子下表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 倍半萜生物合成 | GFTpsC | 古巴烯合成酶 | 催化 | 来源于葡萄柚，催化FPP生成古巴烯，同时产生多种副产物，在GAL1或TPI1启动子下表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 倍半萜生物合成 | PatTps177 | 广藿香醇合成酶 | 催化 | 来源于广藿香，催化FPP生成广藿香醇为主要产物的多种倍半萜，在GAL1启动子下表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | MET3 promoter | — | 调控 | 用于替换ERG9天然启动子，通过添加甲硫氨酸实现ERG9表达的可调控抑制 |
关键发现
- ERG9下调使细胞麦角固醇含量从野生型的18.75±1.92 mg/g DW降至2 mM甲硫氨酸条件下的3.31±0.04 mg/g DW
- 两相发酵中，表达patchoulol合成酶的菌株YIP-0P-02产生patchoulol 6.7 mg/L，总倍半萜18.1 mg/L，产量为1.21 mg/g DW和0.31 mg/g半乳糖
- ERG9抑制菌株YIP-M0-04产生法尼醇终滴度22.6 mg/L，产量10.90 mg/g DW
- 结合ERG9抑制和合成酶表达后，补充更高浓度甲硫氨酸使patchoulol终滴度提高47%（达16.9 mg/L），法尼醇提高82%（达20.2 mg/L）
- 葡萄糖作为碳源时倍半萜产量和产率均低于半乳糖。
研究结论
下调ERG9基因表达可有效增加FPP前体供应，但FPP主要分流至法尼醇而非目标倍半萜，说明合成酶活性是限制因素；通过优化甲硫氨酸补料可显著提高倍半萜产量；酿酒酵母具有作为倍半萜细胞工厂的巨大潜力，两相发酵和启动子调控是可行的代谢工程策略。