Metabolic Engineering of Menaquinone-8 Pathway of Escherichia coli as a Microbial Platform for Vitamin K Production
- 作者
- Min Kyung Kong, Pyung Cheon Lee
- 单位
- Department of Molecular Science and Technology, Ajou University, Woncheon-dong, Yeongtong-gu, Suwon 443-749, South Korea
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2011）
- DOI
- 10.1002/bit.23142
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
大肠杆菌中MK-8（维生素K）产量低，缺乏系统性的代谢工程改造策略来提高其生产效率。
研究策略
通过过表达MK-8合成途径中的头部前体（chorismate途径）和尾部前体（异戊二烯途径）的关键酶，并敲除竞争性Q-8途径的ubiCA基因，以平衡前体供应并阻断副产物合成。
核心内容
该研究通过系统代谢工程改造大肠杆菌，旨在提升甲萘醌-8（MK-8，维生素K）的产量。作者首先比较了六种大肠杆菌菌株，发现JM109和SURE的MK-8基础含量最高，约为55–57 μg/g WCW，是其他菌株的2–3倍。随后对MK-8合成途径中的头部前体（chorismate途径）和尾部前体（异戊二烯途径）关键酶进行过表达，并敲除竞争性辅酶Q-8途径的ubiCA基因以阻断副产物合成。结果表明，过表达MenA或MenD可使MK-8含量从约60 μg/g提高至约150 μg/g（约2倍），而过表达IspA、DXR或IDI则可达到150–180 μg/g。敲除ubiCA使MK-8含量较野生型提高30%。最终在ΔubiCA背景下过表达MenA，使MK-8产量达到290 μg/g WCW，是野生型的5倍，且比仅过表达MenA的菌株高2倍。相比之下，过表达UbiE、MenB、MenC、MenE、MenF及共表达MenD/IspA或MenD/DXR均未显著提升产量。该研究首次对大肠杆菌MK-8途径进行系统改造，证明了通过平衡前体供应并阻断竞争途径可有效引导醌类通量流向MK-8合成，为利用大肠杆菌作为维生素K生产平台提供了可行策略。
创新点
首次对大肠杆菌MK-8途径进行系统性代谢工程改造；发现MenA和MenD是MK-8合成关键酶；通过敲除ubiCA并过表达MenA使MK-8产量提高至290 μg/g WCW，较野生型提高约5倍。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli (JM109/ΔubiCA) | MK-8生物合成途径 | menA | 1,4-二羟基-2-萘甲酸辛异戊烯基转移酶 | 催化 | MK-8头部结构前体1,4-二羟基-2-萘甲酸与尾部OPP的缩合酶；过表达使MK-8含量提高约2倍（~150 μg/g WCW）；在ΔubiCA中过表达产量达290 μg/g WCW（野生型5倍） |
| Escherichia coli (JM109/ΔubiCA) | MK-8生物合成途径 | menB | 萘酸合酶 | 催化 | 催化MK-8中间体合成；过表达对MK-8产量有积极影响 |
| Escherichia coli (JM109/ΔubiCA) | MK-8生物合成途径 | menC | 邻琥珀酰苯甲酸-CoA合成酶 | 催化 | 参与MK-8头部前体合成；过表达有积极影响 |
| Escherichia coli (JM109/ΔubiCA) | MK-8生物合成途径 | menD | 2-琥珀酰-6-羟基-2,4-环己二烯-1-羧酸合成酶/2-酮戊二酸脱羧酶 | 催化 | MK-8早期前体合成关键酶；过表达使MK-8含量提高约2倍 |
| Escherichia coli (JM109/ΔubiCA) | MK-8生物合成途径 | menE | 邻琥珀酰苯甲酸-CoA连接酶 | 催化 | 参与MK-8头部前体合成；过表达有积极影响 |
| Escherichia coli (JM109/ΔubiCA) | MK-8生物合成途径 | menF | 甲萘醌特异性异分支酸合酶 | 催化 | 参与MK-8头部前体合成；过表达有积极影响 |
| Escherichia coli (JM109/ΔubiCA) | Q-8/MK-8生物合成途径 | ubiE | 泛醌/甲萘醌生物合成甲基转移酶 | 催化 | 参与Q-8和MK-8的甲基化；过表达可提高MK-8含量，但DMK-8积累异常 |
| Escherichia coli (JM109/ΔubiCA) | 异戊二烯前体（MEP）途径 | ispA | 香叶基转移酶 | 催化 | 参与异戊二烯前体合成，增强OPP供应；过表达使MK-8含量达150-180 μg/g WCW |
| Escherichia coli (JM109/ΔubiCA) | 异戊二烯前体（MEP）途径 | dxr | 1-脱氧-α-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | MEP途径关键酶，增强异戊二烯前体；过表达提高MK-8含量至150-180 μg/g WCW |
| Escherichia coli (JM109/ΔubiCA) | 异戊二烯前体（MEP）途径 | idi | 异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | 促进IPP/DMAPP平衡；过表达提高MK-8含量至150-180 μg/g WCW |
| Escherichia coli (JM109/ΔubiCA) | Q-8生物合成途径 | ubiC | 分支酸裂解酶 | 催化 | Q-8途径第一个酶，分支酸裂解酶；本研究敲除ubiCA以阻断Q-8合成 |
| Escherichia coli (JM109/ΔubiCA) | Q-8生物合成途径 | ubiA | 4-羟基苯甲酸辛异戊烯基转移酶 | 催化 | Q-8途径酶，与ubiC一起被敲除以阻断Q-8合成 |
关键发现
- 在六种大肠杆菌菌株中，JM109和SURE的MK-8含量最高，为55-57 μg/g WCW，是其他菌株的2-3倍。（2）过表达MenA或MenD使MK-8含量从~60 μg/g WCW提高至~150 μg/g WCW（约2倍）
- 过表达IspA、DXR或IDI使MK-8含量达到150-180 μg/g WCW。（3）ΔubiCA突变体使MK-8含量较野生型提高30%（80 vs 60 μg/g WCW）。（4）在ΔubiCA中过表达MenA使MK-8含量达到290 μg/g WCW，是野生型的5倍，比仅过表达MenA的菌株高2倍。（5）过表达UbiE、MenB、MenC、MenE、MenF未显著提高MK-8含量。（6）共表达MenD/IspA或MenD/DXR的MK-8含量为110-130 μg/g WCW，低于单独过表达MenD。
研究结论
通过调节OPP和1,4-二羟基-2-萘甲酸前体途径的表达水平并阻断竞争性Q-8途径，能够有效引导醌类通量流向MK-8生物合成，该策略可显著提升大肠杆菌作为维生素K生产平台的效率。