Metabolic Engineering of Escherichia coli for the Production of 1,2-Propanediol From Glycerol
- 作者
- James M. Clomburg, Ramon Gonzalez
- 单位
- Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Rice University; Department of Bioengineering, Rice University
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2011）
- DOI
- 10.1002/bit.22993
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何利用甘油作为底物，通过代谢工程改造大肠杆菌高效生产1,2-丙二醇（1,2-PDO）
研究策略
组合代谢工程策略：过表达1,2-PDO合成途径基因（mgsA、gldA、yqhD），用来自Citrobacter freundii的ATP依赖性二羟丙酮激酶替换内源PEP依赖性DHAK以增加DHAP供应，并敲除乙酸、乳酸合成途径以优化产物分布
核心内容
该研究通过组合代谢工程策略，将大肠杆菌MG1655改造为能以甘油为底物高效生产1,2-丙二醇（1,2-PDO）的菌株。研究者过表达了甲基乙二醛合酶（mgsA）、甘油脱氢酶（gldA）和醛氧化还原酶（yqhD）构成合成途径，并以来自弗氏柠檬杆菌的ATP依赖性二羟丙酮激酶替换内源PEP依赖性激酶以增强前体磷酸二羟丙酮的供应，同时敲除乙酸和乳酸合成途径以减少副产物分流。最终菌株在受控发酵罐中以30 g/L甘油为底物，72小时产生5.6 g/L 1,2-PDO，产率达21.3%（w/w），优于以葡萄糖为底物时的4.5 g/L，且利用粗甘油时产量相当。实验还揭示1,2-PDO合成依赖乙醇作为共产物维持氧化还原平衡和ATP供给，敲除丙酮酸脱氢酶（aceF）或甲酸氢裂解酶（fdhF）分别使产量降至4.2和3.9 g/L，双重敲除进一步降至2.7 g/L。该工作首次报道了利用甘油生产1,2-PDO的大肠杆菌代谢工程策略，其产量和产率均优于已有葡萄糖途径的报道，且可直接利用粗甘油，显示出良好的工业化应用潜力。
创新点
首次报道利用甘油生产1,2-PDO的大肠杆菌代谢工程；通过替换DHAK提高前体DHAP可用性；结合敲除竞争途径实现高产量
研究对象（14）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli MG1655 | 1,2-PDO合成途径 | mgsA | 甲基乙二醛合酶 | 催化 | 过表达，催化DHAP转化为甲基乙二醛 |
| Escherichia coli MG1655 | 1,2-PDO合成途径 | gldA | 甘油脱氢酶 | 催化 | 过表达，催化甘油氧化为二羟丙酮，也参与甲基乙二醛还原 |
| Escherichia coli MG1655 | 1,2-PDO合成途径 | yqhD | 醛氧化还原酶（1,2-丙二醇还原酶活性） | 催化 | 过表达，催化甲基乙二醛/乙偶姻还原为1,2-PDO |
| Escherichia coli MG1655 | 1,2-PDO合成途径 | fucO | 1,2-丙二醇还原酶 | 催化 | 过表达备选基因，实验中与yqhD比较 |
| Escherichia coli MG1655 | 甘油发酵途径（DHAP供应） | dhaKL (Citrobacter freundii) | ATP依赖性二羟丙酮激酶 | 催化 | 异源表达，替换内源PEP依赖性DHAK，增加DHAP可用性 |
| Escherichia coli MG1655 | 甘油发酵途径 | dhaK | PEP依赖性二羟丙酮激酶（内源） | 催化 | 敲除以阻断内源DHAK，利于ATP依赖性DHAK发挥作用 |
| Escherichia coli MG1655 | 乙酸合成途径 | ackA-pta | 乙酸激酶-磷酸转乙酰酶 | 催化 | 敲除，阻断乙酸生成，提高1,2-PDO产量 |
| Escherichia coli MG1655 | 乳酸合成途径 | ldhA | 乳酸脱氢酶 | 催化 | 敲除，阻断乳酸生成，提高1,2-PDO产量 |
| Escherichia coli MG1655 | 丙酮酸代谢（PDH复合物） | aceF | 丙酮酸脱氢酶复合物E2组分 | 催化 | 敲除研究，证明PDH活性对1,2-PDO生产有贡献 |
| Escherichia coli MG1655 | 甲酸氢裂解酶（FHL） | fdhF | 甲酸氢裂解酶（甲酸脱氢酶H） | 催化 | 敲除研究，影响氢循环，降低1,2-PDO产量 |
| Escherichia coli MG1655 | 乙醇合成途径 | adhE | 乙醛/醇脱氢酶 | 催化 | 过表达用于回补实验，证明乙醇为必需共产物 |
| Escherichia coli MG1655 | 富马酸还原途径 | frdA | 富马酸还原酶亚基A | 催化 | 敲除后1,2-PDO产量下降，参与氢循环 |
| Escherichia coli MG1655 | 甲基乙二醛解毒途径 | gloA | 乙二醛酶I | 催化 | 敲除实验，对1,2-PDO生产无明显影响 |
| Escherichia coli MG1655 | 内源乙醛代谢 | aldA | 乳醛脱氢酶 | 催化 | 敲除实验，对1,2-PDO生产无明显影响 |
关键发现
- 经过组合改造的菌株MG1655 ΔackA-pta ΔldhA ΔdhaK (pTHKLcfgldAmgsAyqhD)在受控发酵罐中利用30 g/L甘油，72 h产生5.6 g/L 1,2-PDO，产率21.3% (w/w)
- 该产量优于E. coli利用葡萄糖的4.5 g/L。使用粗甘油时产量相当。1,2-PDO合成需要乙醇作为共产物以维持氧化还原平衡和ATP供给
- 敲除PDH（aceF）和FHL（fdhF）分别使产量降至4.2 g/L和3.9 g/L，同时敲除降至2.7 g/L。理论最大产率从甘油为0.72 g/g。实验中还发现PDH活性和氢循环对氧化还原平衡有贡献。
研究结论
通过Rational代谢工程策略成功构建了能从甘油高效生产1,2-PDO的大肠杆菌菌株，产量和产率优于以葡萄糖为底物的已有报道，并可直接利用粗甘油，显示了工业化应用潜力。