高级醇 · 代谢工程文献库

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Induction of ganoderic acid biosynthesis by Mn2+ in static liquid cultivation of Ganoderma lucidum

作者
Yi-Ning Xu, Xiao-Xia Xia, Jian-Jiang Zhong
单位
State Key Laboratory of Microbial Metabolism and Laboratory of Molecular Biochemical Engineering, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, 800 Dong-Chuan Road, Shanghai, 200240, China
杂志
Biotechnology and Bioengineering
DOI
10.1002/bit.25288
所属领域
代谢工程
关键词
Ganoderma lucidumantitumor triterpenoidcalcineurin signalmedicinal mushroom fermentationsecondary metabolism
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解决的核心问题

Mn2+在蘑菇次级代谢中的作用尚不清楚，通过添加Mn2+提高抗肿瘤灵芝酸（GAs）产量并阐明其调控机制。

研究策略

在灵芝静态液体培养中添加不同浓度MnCl2，筛选最佳添加时间和浓度；通过基因表达分析（qRT-PCR）、钙调磷酸酶抑制剂（环孢素A）处理、Ca2+荧光成像及胞内外离子浓度测定，揭示Mn2+通过钙调磷酸酶信号通路调控GA生物合成的机制。

研究路线图

100%
问题：Mn2+调控灵芝酸合成机制未知
策略：静态液体培养添加不同浓度MnCl2，筛选最优条件
关键改造：10 mM Mn2+第2天添加，产量最高
结果：总GA产量提高2.2倍
四种单体GA均显著提升（1.78~2.76倍）
机制：基因表达分析+qRT-PCR+环孢素A+Ca2+成像
关键发现：Mn2+上调hmgr、sqs、ls、cam、cna、crz1、pmr1基因表达
结论：Mn2+触发Ca2+内流→激活钙调磷酸酶信号→上调GA基因
应用：信号转导工程提高蘑菇次生代谢产物
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核心内容

本研究针对Mn2+在灵芝次级代谢调控中作用不明的瓶颈，在灵芝静态液体培养体系中系统考察了Mn2+对灵芝酸（GAs）生物合成的诱导效应及其分子机制。研究通过添加不同浓度MnCl2并筛选最佳添加时间，发现第2天添加10 mM Mn2+时总灵芝酸产量较对照提高2.2倍，且对细胞生长无明显抑制作用；四种单体灵芝酸GA-Mk、GA-T、GA-S和GA-Me的产量分别达到211.25、164.35、59.19和72.11 mg/L，为对照的1.78至2.76倍。机制层面，qRT-PCR显示Mn2+显著上调甲羟戊酸途径关键基因hmgr、sqs、ls以及钙调磷酸酶信号通路相关基因cam、cna、crz1和pmr1的表达；钙调磷酸酶抑制剂环孢素A可逆转上述上调，而Mn2+能部分恢复其表达。进一步通过Ca2+荧光成像和胞内外离子浓度测定，发现Mn2+添加导致胞外Ca2+浓度下降而胞内Ca2+浓度上升，提示Mn2+经由PMR1促进Ca2+内流，进而激活钙调磷酸酶信号级联，最终增强灵芝酸生物合成。该研究首次揭示了Mn2+通过PMR1介导的Ca2+内流激活钙调磷酸酶信号通路这一新调控路径，为利用信号转导工程策略提升蘑菇次级代谢产物产量提供了可行方法。

创新点

首次报道Mn2+通过钙调磷酸酶信号转导上调灵芝酸生物合成基因；10 mM Mn2+添加使总灵芝酸产量提高2.2倍；揭示了Mn2+通过PMR1促进Ca2+内流激活钙调磷酸酶信号这一新调控路径。

研究对象（7）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Ganoderma lucidum 甲羟戊酸途径 hmgr 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 催化 灵芝酸生物合成关键酶，催化HMG-CoA生成甲羟戊酸
Ganoderma lucidum 甲羟戊酸途径 sqs 角鲨烯合酶 催化 催化两分子法尼基焦磷酸合成角鲨烯
Ganoderma lucidum 甲羟戊酸途径 ls 羊毛固醇合酶 催化 催化角鲨烯环化生成羊毛固醇，是灵芝酸前体
Ganoderma lucidum 钙调磷酸酶信号通路 cam 钙调蛋白 调控 钙离子传感器，与Ca2+结合后激活钙调磷酸酶
Ganoderma lucidum 钙调磷酸酶信号通路 cna 钙调磷酸酶亚基A 调控 钙调磷酸酶催化亚基，受钙调蛋白调控
Ganoderma lucidum 钙调磷酸酶信号通路 crz1 钙调磷酸酶响应锌指转录因子 调控 去磷酸化后入核调控下游基因表达
Ganoderma lucidum 钙调磷酸酶信号通路 pmr1 质膜相关Ca2+/Mn2+ P型ATP酶 转运 参与细胞内Mn2+稳态，并可能促进Ca2+内流

关键发现

  1. 添加10 mM Mn2+使总灵芝酸产量提高2.2倍
  2. 四种单体灵芝酸GA-Mk、GA-T、GA-S和GA-Me的产量分别为211.25±0.73、164.35±1.11、59.19±0.30和72.11±0.95 mg/L，分别是对照的2.13、2.73、2.76和1.78倍
  3. Mn2+对细胞生长无显著影响
  4. 第2天添加10 mM Mn2+时灵芝酸产量最高
  5. Mn2+诱导了hmgr、sqs、ls、cam、cna、crz1和pmr1基因的表达上调，而环孢素A抑制这些表达，Mn2+可部分恢复
  6. Mn2+添加导致胞外Ca2+浓度下降而胞内Ca2+浓度上升，提示Ca2+内流。

研究结论

Mn2+添加是一种有效的诱导策略，通过PMR1引起Ca2+内流，激活钙调磷酸酶信号通路，上调灵芝酸生物合成基因，从而提高灵芝酸产量。该研究为利用信号转导工程提高蘑菇次级代谢产物产量提供了新方法。