Directed Evolution of a Highly Efficient Cellobiose Utilizing Pathway in an Industrial Saccharomyces cerevisiae strain
- 作者
- Yongbo Yuan, Huimin Zhao
- 单位
- Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Institute for Genomic Biology, Urbana, Illinois, 61801; Departments of Chemistry, Biochemistry, and Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, Illinois
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2013）
- DOI
- 10.1002/bit.24946
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
在工业酿酒酵母中实现高效纤维二糖利用，以解决纤维素生物燃料生产中的瓶颈问题，核心是平衡和增加异源途径的通量以达到高产量和高生产率。
研究策略
将定向进化与启动子工程相结合：通过易错PCR产生ENO2和PDC1启动子突变文库，利用DNA assembler方法将启动子突变文库与CDT和BGL基因组装成途径文库，通过菌落大小和乙醇产量进行高通量筛选，多轮循环迭代优化途径基因表达水平。
核心内容
该研究针对工业酿酒酵母中纤维二糖利用效率低下的瓶颈，提出将定向进化与启动子工程相结合的优化策略。研究人员通过易错PCR构建ENO2和PDC1启动子突变文库，利用DNA assembler技术将突变启动子与cdt-1和gh1-1基因组装成途径文库，并以菌落大小和乙醇产量为指标进行高通量筛选，经三轮迭代进化获得优化菌株#9-1-18。与亲本相比，该菌株的纤维二糖消耗率从0.388 g/L/h提高至2.50 g/L/h，提升6.41倍；乙醇生产率从0.137 g/L/h提高至0.89 g/L/h，提升6.36倍。基因表达分析显示，CDT表达水平在进化过程中逐步提高至亲本的24.40倍，而BGL/CDT比值从亲本的13.8降至1.7至2.8，表明途径通量的平衡是高效利用的关键。进化菌株胞外葡萄糖积累约10 g/L，高于亲本的4 g/L，提示β-葡萄糖中间代谢物的转运与水解协调对整体通量具有重要影响。该研究证明定向进化与启动子工程联用可在无需详细途径知识的情况下快速优化多基因异源途径，为工业菌株的代谢工程改造提供了高效通用方法。
创新点
首次将定向进化与启动子工程相结合用于多基因途径优化；无需详细途径和宿主知识即可快速优化；优化后的途径可直接整合到染色体中，无需昂贵诱导剂。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 工业酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae，菌株Still Spirits Classic Turbo Distiller's Yeast) | 纤维二糖利用途径 | cdt-1 | CDT (cellobiose transporter) | 转运 | 来源于粗糙脉孢菌 (Neurospora crassa)，负责纤维二糖跨膜转运 |
| 工业酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae，菌株Still Spirits Classic Turbo Distiller's Yeast) | 纤维二糖利用途径 | gh1-1 | BGL (β-glucosidase) | 催化 | 来源于粗糙脉孢菌 (Neurospora crassa)，催化纤维二糖水解为β-葡萄糖 |
关键发现
- 最终菌株#9-1-18与亲本相比，纤维二糖消耗率提高6.41倍（从0.388 g/L/h提高到2.50 g/L/h），乙醇生产率提高6.36倍（从0.137 g/L/h提高到0.89 g/L/h）。第一轮进化菌株#9的纤维二糖消耗率和乙醇生产率分别为2.24 g/L/h和0.77 g/L/h，比亲本提高5.7倍和5.5倍
- 第二轮#9-1分别提高至2.50 g/L/h和0.81 g/L/h，进一步提高11.6%和5.2%
- 第三轮#9-1-18与第二轮相当。CDT基因表达水平在#9、#9-1、#9-1-18中分别提高13.89倍、16.05倍和24.40倍，BGL基因表达水平分别提高2.56倍、3.24倍和3.00倍。BGL/CDT比值从亲本的13.8降至进化菌株的1.7-2.8。ENO2和PDC1启动子平均突变率分别为12个/kb和16个/kb。筛选了约2×10^5个菌株。进化菌株胞外葡萄糖积累约10 g/L，高于亲本的4 g/L。
研究结论
通过定向进化与启动子工程相结合的策略，成功创建了高效利用纤维二糖的工业酿酒酵母菌株，大幅提高了纤维二糖消耗率和乙醇生产率。研究表明，CDT和BGL基因的绝对表达水平、BGL/CDT比例以及β-葡萄糖中间代谢物是影响纤维二糖利用的关键因素。该策略为代谢工程中异源途径优化提供了快速高效的新方法。