Construction of a Controllable β-carotene Biosynthetic Pathway by Decentralized Assembly Strategy in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Wenping Xie, Min Liu, Xiaomei Lv, Wenqiang Lu, Jiali Gu, Hongwei Yu
- 单位
- Institute of Bioengineering, Department of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, PR China
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2014）
- DOI
- 10.1002/bit.25002
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在酿酒酵母中构建可控且遗传稳定的多基因异源生物合成途径，解决重复序列重组和途径开关难以调控的问题。
研究策略
利用GAL调控系统，设计标记可循环整合质粒pMRI，采用去中心化组装策略将途径分为多个功能模块整合到不同基因组位点，并通过敲除GAL80和控制碳源组成来调节途径的开关时间。
研究路线图
核心内容
本研究针对酿酒酵母中多基因异源合成途径构建时重复序列易引发重组、途径开关难以精确调控的问题，采用去中心化组装策略，设计了标记可循环整合质粒pMRI，将约16 kb的β-胡萝卜素合成途径划分为多个功能模块，分别整合至不同基因组位点，并通过敲除GAL80及调控培养基中葡萄糖/甘油比例实现对途径表达时相的灵活控制。结果显示各轮整合效率达80%–100%，经模块化整合与优化后，总类胡萝卜素产量达11 mg/g DCW（72.57 mg/L），其中β-胡萝卜素含量为7.41 mg/g DCW，较仅表达crtYB/crtI的菌株提高367倍；调整碳源为1%葡萄糖+1%甘油后，总类胡萝卜素产量较2%葡萄糖组提高37.4%，β-胡萝卜素提高51%。工程菌株经20代传代后仍保持遗传稳定。该工作证明去中心化组装结合可诱导调控系统能在基因组水平构建可控且稳定的多基因途径，为其他复杂异源途径的构建提供了可推广的策略。
创新点
['设计了pMRI系列标记可循环整合质粒，支持多次整合和标记回收', '采用去中心化组装策略，将途径模块分散整合到多个基因组位点，避免重复序列引起的重组', '通过敲除GAL80并调节葡萄糖/甘油比例，实现途径开关时间的可控调节']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 甲羟戊酸途径/β-胡萝卜素合成途径 | crtE | GGPP合酶 | 催化 | 整合于HMG1位点，用于提高GGPP前体供给 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | β-胡萝卜素合成途径 | crtYB | 双功能植物烯合酶/番茄红素环化酶 | 催化 | 整合于HO和Ty4位点，两个拷贝以解除限速步骤 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | β-胡萝卜素合成途径 | crtI | 植物烯脱氢酶 | 催化 | 整合于HO和Ty4位点，两个拷贝以解除限速步骤 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 甲羟戊酸途径 | tHMG1 | 截短的HMG-CoA还原酶催化域 | 催化 | 整合于HMG1位点，消除MVA途径限速步骤 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | GAL调控网络 | GAL80 | Gal80p转录抑制因子 | 调控 | 敲除后使途径开关仅受葡萄糖通过Snf1信号通路控制 |
关键发现
- 构建了约16 kb的β-胡萝卜素合成途径，各轮整合效率为80%-100%
- 通过模块化整合和优化，总类胡萝卜素产量达到11 mg/g DCW（72.57 mg/L），β-胡萝卜素含量为7.41 mg/g DCW，较仅表达crtYB/crtI的菌株提高367倍
- 敲除GAL80后，在YPD培养基中产量为8.005 mg/g DCW
- 调整碳源（1%葡萄糖+1%甘油）后总类胡萝卜素产量较2%葡萄糖提高37.4%，β-胡萝卜素提高51%
- 工程菌株经过20代传代后仍保持遗传稳定。
研究结论
通过去中心化组装和GAL调控系统，成功在酿酒酵母基因组中构建了可控且遗传稳定的β-胡萝卜素合成途径，实现了高产，该策略可推广至其他多基因途径的构建。