Optimization of an acetate reduction pathway for producing cellulosic ethanol by engineered yeast
- 作者
- Guo-Chang Zhang, In Iok Kong, Na Wei, Dairong Peng, Timothy L Turner, Bong Hyun Sung, Jung-Hoon Sohn, Yong-Su Jin
- 单位
- Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign; Department of Food Science and Human Nutrition, University of Illinois at Urbana-Champaign; Department of Civil and Environmental Engineering and Earth Sciences, University of Notre Dame; Bioenergy and Biochemical Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2017）
- DOI
- 10.1002/bit.26021
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
工程酵母在利用木糖生产纤维素乙醇时，面临XR-XDH途径的氧化还原失衡以及纤维素水解液中乙酸抑制的问题，导致乙醇产量低、副产物多，乙酸未被有效脱毒。
研究策略
通过密码子优化和增加拷贝数过表达乙酸还原途径的关键酶AADH和ACS，结合CRISPR-Cas9基因组整合构建不同酶活水平的工程菌株，并通过环境扰动（葡萄糖脉冲）和遗传扰动（GPD启动子截短和缺失）探索限速因素，实现木糖与乙酸同步共利用。
核心内容
针对工程酵母在纤维素乙醇生产中因XR-XDH途径氧化还原失衡及乙酸抑制导致产量低的问题，本研究通过密码子优化和拷贝数增加，在酿酒酵母SR8中过表达乙酸还原途径的关键酶AADH与突变型ACS，并借助CRISPR-Cas9实现基因组整合，构建了不同酶活水平的系列菌株。在含有20 g/L葡萄糖、80 g/L木糖和8 g/L乙酸的培养基中，优化菌株SR8A6S3消耗乙酸7.1 g/L，乙醇产量达43.33 g/L，较对照SR8提高42.6%；乙醇产率从0.344 g/g糖提升至0.446 g/g糖，同时甘油和木糖醇产率分别降低69.7%和71.8%。环境扰动实验与GPD启动子截短或缺失均未改善乙酸消耗，表明关键酶活性而非辅因子供给是主要限制因素。在真实纤维素水解液中，该菌株实现了迄今最高的木糖乙醇产率0.463 g/g木糖，乙醇产率提高18.4%。这一策略有效利用木糖代谢过剩的NADH驱动乙酸原位脱毒并转化为乙醇，为工业纤维素乙醇生产提供了可行方案。
创新点
['报道了迄今最高的木糖乙醇产率（0.463 g乙醇/g木糖），由XR-XDH途径工程菌株获得', '利用木糖代谢产生的过剩NADH驱动乙酸还原途径，实现乙酸原位脱毒并同步转化为乙醇', '通过密码子优化和拷贝数增加大幅提高AADH和ACS酶活，显著促进乙酸消耗', '在真实纤维素水解液中验证了优化菌株SR8A6S3的优越性能，乙醇产率提高18.4%']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae SR8 | 木糖利用途径（XR-XDH） | — | xylose reductase (XR) | 催化 | 来自Scheffersomyces stipitis，NADPH依赖，催化木糖还原为木糖醇 |
| Saccharomyces cerevisiae SR8 | 木糖利用途径（XR-XDH） | — | xylitol dehydrogenase (XDH) | 催化 | 来自Scheffersomyces stipitis，NAD+依赖，催化木糖醇氧化为木酮糖 |
| Saccharomyces cerevisiae SR8 | 乙酸还原途径 | adhE | acetylating acetaldehyde dehydrogenase (AADH) | 催化 | 来自Escherichia coli，密码子优化后表达增强，催化乙酰-CoA还原为乙醛进而生成乙醇 |
| Saccharomyces cerevisiae SR8 | 乙酸还原途径 | SeACS (L641P) | mutant acetyl-CoA synthetase (ACS*) | 催化 | 来自Salmonella enterica，L641P突变减弱乙酰-CoA反馈抑制，催化乙酸转化为乙酰-CoA |
| Saccharomyces cerevisiae SR8 | 甘油合成途径（NADH再生） | GPD1 | glycerol-3-phosphate dehydrogenase (Gpd1) | 催化 | 启动子截短以减少甘油合成，从而增加细胞内NADH水平，但未改善乙酸消耗 |
| Saccharomyces cerevisiae SR8 | 甘油合成途径（NADH再生） | GPD2 | glycerol-3-phosphate dehydrogenase (Gpd2) | 催化 | 基因敲除以减少甘油合成，但导致生长受损，乙酸消耗未增加 |
关键发现
['在YP培养基（20 g/L葡萄糖、80 g/L木糖、8 g/L乙酸）中，优化菌株SR8A6S3消耗乙酸7.1 g/L，乙醇产量43.33 g/L，比对照SR8（30.39 g/L）提高42.6%', '乙醇产率从0.344 g/g糖提高到0.446 g/g糖（提高29.7%），甘油产率从0.089 g/g糖降至0.027 g/g糖（降低69.7%），木糖醇产率从0.085 g/g木糖降至0.024 g/g木糖（降低71.8%）', '在纤维素水解液中，SR8A6S3消耗乙酸4.11 g/L，乙醇产率提高18.4%（0.395 vs 0.468 g/g糖），甘油产率从0.073降至0.033 g/g糖，木糖醇产率从0.112降至0.078 g/g木糖', 'SR8A4的AADH活性比SR8A2高3倍，SR8A6S3的ACS活性比其他菌株高2倍', '葡萄糖脉冲喂料和GPD1启动子截短/GPD2敲除均未改善乙酸消耗，表明AADH和ACS酶活是主要限制因素']
研究结论
通过优化乙酸还原途径中AADH和ACS的表达水平，可以显著提高工程酵母在木糖发酵中的乙酸消耗和乙醇产量，同时减少副产物。主要限制因素为关键酶活性而非ATP或NADH水平。优化菌株SR8A6S3在纤维素水解液中实现了最高木糖乙醇产率（0.463 g/g木糖），为工业纤维素乙醇生产提供了有效策略。