Synthesis of chiral 2-alkanols from n-alkanes by a P. putida Whole-Cell Biocatalyst
- 作者
- Florian Tieves, Isabelle N. Erenburg, Osama Mahmoud, Vlada B. Urlacher
- 单位
- Institute of Biochemistry, Heinrich-Heine University Düsseldorf, 40225, Düsseldorf, Germany
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2017）
- DOI
- 10.1002/bit.25953
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
利用P450单加氧酶CYP154A8全细胞催化烷烃生产手性2-烷醇，解决非活化C-H键选择性羟基化的难题，并克服底物毒性、溶解性及辅因子供给等限制。
研究策略
将CYP154A8与不同氧化还原伴侣（Pdx/PdR和YkuN/FdR）分别共表达于大肠杆菌和恶臭假单胞菌全细胞体系中，优化能量来源和添加甲基-β-环糊精，并通过共表达LB-ADH提高产物对映体纯度。
研究路线图
核心内容
本研究构建了基于恶臭假单胞菌P. putida DSM 12264的全细胞生物催化剂，用于将非活化烷烃选择性羟化为手性2-烷醇。研究人员将P450单加氧酶CYP154A8与不同氧化还原伴侣（Pdx/PdR和YkuN/FdR）共表达于P. putida和大肠杆菌中，并优化了能量来源、添加甲基-β-环糊精以改善底物溶解性，同时共表达LB-ADH以提高产物对映体纯度。结果显示，P. putida中CYP154A8表达量达1,224 nmol/g_cdw，远高于大肠杆菌的53 nmol/g_cdw。以辛烷为底物时，优化体系产生约16 mM (S)-2-辛醇（87% ee），比游离酶体系高7倍以上。共表达LB-ADH后，辛烷、庚烷和壬烷分别产生5.4 mM (97% ee)、2.6 mM (91% ee)和5.5 mM (97% ee)的相应手性2-烷醇。采用YkuN/FdR伴侣时总周转数达10,300，显著优于Pdx/PdR体系。该研究首次将CYP154A8整合至溶剂耐受的P. putida全细胞系统，实现了目前报道的最高手性2-烷醇产量和对映体纯度，为工业级生物催化烷烃羟基化提供了可行方案。
创新点
首次将CYP154A8整合到溶剂耐受的P. putida全细胞系统中，实现了迄今P450全细胞体系中最高的手性2-烷醇产量；通过共表达ADH将产物ee值最高提升至99%。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| P. putida DSM 12264 | 烷烃羟基化 | CYP154A8 | CYP154A8 | 催化 | 来自Nocardia farcinica的P450单加氧酶，催化烷烃C2位区域和立体选择性羟基化 |
| P. putida DSM 12264 | 烷烃羟基化 | pdx | Pdx (putidaredoxin) | 能量供给 | 电子伴侣蛋白，传递电子至CYP154A8 |
| P. putida DSM 12264 | 烷烃羟基化 | pdr | PdR (putidaredoxin reductase) | 能量供给 | NADH依赖的还原酶，为Pdx提供电子 |
| P. putida DSM 12264 | 烷烃羟基化 | ykuN | YkuN (flavodoxin) | 能量供给 | 来自Bacillus subtilis的黄素氧还蛋白，用于电子传递 |
| P. putida DSM 12264 | 烷烃羟基化 | fdr | FdR (flavodoxin reductase) | 能量供给 | 来自E. coli的NADPH依赖黄素氧还蛋白还原酶 |
| P. putida DSM 12264 | 烷烃羟基化 | lb-adh | LB-ADH (alcohol dehydrogenase) | 催化 | 来自Lactobacillus brevis的ADH，选择性氧化(R)-2-醇为2-酮，提高(S)-产物ee值 |
| P. putida DSM 12264 | 烷烃羟基化 | gdh | GDH (glucose dehydrogenase) | 催化 | 来自Bacillus megaterium，用于辅因子NADPH再生 |
| E. coli JM109 | 烷烃羟基化 | CYP154A8 | CYP154A8 | 催化 | 与P. putida比较，表达量较低，产率较低 |
关键发现
- P. putida中CYP154A8表达量为1,224 nmol/g_cdw，远高于E. coli的53 nmol/g_cdw
- 以辛烷为底物时，优化后的P. putida全细胞系统产生约16 mM (S)-2-辛醇（87% ee），比游离酶体系高7倍以上
- 添加ADH后，辛烷转化产生5.4 mM (S)-2-辛醇（97% ee），庚烷产生2.6 mM (S)-2-庚醇（91% ee），壬烷产生5.5 mM (S)-2-壬醇（97% ee）
- 使用YkuN/FdR伴侣时TTN达4,400（无ADH）和10,300（有ADH），而Pdx/PdR体系TTN仅1,100和1,000。
研究结论
P. putida DSM 12264作为全细胞宿主优于E. coli JM109，结合YkuN/FdR氧化还原伴侣和LB-ADH，以及甘油作为能源，能够高效且高对映选择性地将C7-C9烷烃转化为手性2-烷醇，产率和对映体纯度均为目前报道的最高水平。