A Process for the Production of Human Proinsulin in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Hanne V. Tøttrup, Søren Carlsen
- 单位
- Research and Development Division, Nordisk Gentofte A/S, DK-2820 Gentofte, Denmark
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（1989）
- DOI
- 10.1002/bit.260350403
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
开发一种在酿酒酵母中大规模发酵生产人胰岛素原的工艺，克服胞内表达不稳定、产量低的问题，并保持遗传稳定性。
研究策略
利用受葡萄糖抑制/去抑制的ADH2-GAPDH杂合启动子调控SOD-PI融合蛋白的胞内表达；在繁殖期通过维持葡萄糖过量来抑制表达，保持遗传稳定性；在补料分批发酵中先以葡萄糖补料繁殖，再切换为乙醇补料诱导表达，同时降低培养温度以提高产量。
核心内容
该研究开发了一套在酿酒酵母中大规模生产人胰岛素原（以SOD-PI融合蛋白形式）的补料分批发酵工艺。研究者利用受葡萄糖抑制/去抑制调控的ADH2-GAPDH杂合启动子驱动融合蛋白表达，通过繁殖期维持葡萄糖过量来抑制表达，从而保证质粒和表达潜力的遗传稳定性；在诱导阶段则切换为乙醇补料并降低温度以提高产量。关键结果包括：在复合培养基中维持葡萄糖过量可保持表达潜力60代以上，而诱导条件下3代即损失50%；葡萄糖与乙醇两阶段补料策略将产量从仅葡萄糖补料时的700 mg/L提升至1200 mg/L；将温度从30°C降至26°C后产量进一步增至1600 mg/L，最终在200 L规模发酵中获得超过1500 mg/L的融合蛋白。该工艺证明了“先稳定繁殖、后诱导表达”的两阶段策略可有效兼顾遗传稳定性与高产，为大规模重组人胰岛素原生产提供了可行的工业化路线。
创新点
1. 证明在复合培养基中维持葡萄糖过量可将表达潜力保持60代以上；2. 开发了葡萄糖补料后乙醇补料的两阶段补料策略，避免早期诱导导致的不稳定；3. 将发酵温度从30°C降至26°C显著提高SOD-PI产量；4. 工艺放大至200 L规模，产量超过1500 mg/L。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae PO17 | 重组蛋白表达 | SOD-PI融合基因（人SOD1基因与胰岛素原基因融合） | SOD-PI融合蛋白 | 催化 | 目标产物，SOD与胰岛素原通过甲硫氨酸连接，可经CNBr裂解生成人胰岛素原 |
| Saccharomyces cerevisiae PO17 | 基因表达调控 | ADH2-GAPDH杂合启动子 | — | 调控 | 受葡萄糖抑制，葡萄糖耗尽时去抑制，驱动SOD-PI表达 |
| Saccharomyces cerevisiae PO17 | 亮氨酸生物合成 | LEU2 | β-异丙基苹果酸脱氢酶 | 催化 | 质粒上的选择标记，用于维持质粒的亮氨酸原养型选择 |
关键发现
- 诱导条件下表达潜力3代后损失50%，10代后损失90%
- 在YEP+3%葡萄糖中60代后仍保持>90%表达潜力，而在IS1选择性培养基中30代后降至50%。YEP+3%葡萄糖中比生长速率为0.55 h⁻¹，IS1/IS2+3%葡萄糖中为0.22 h⁻¹。葡萄糖限制恒化器中，表达量约每代损失20%。分批发酵中，5%葡萄糖时总产量约500 mg/L（后期实验可达700 mg/L），比产量约10 mg/L/OD
- 7%葡萄糖时产量极低。补料分批中，仅葡萄糖补料（1.5 g/L/h）产量为700 mg/L，比产量5 mg/L/OD
- 葡萄糖补料40-45 h后换乙醇补料（1.0 g/L/h）产量提高至1200 mg/L，比产量8 mg/L/OD。温度降至26°C后，葡萄糖+乙醇补料产量达1600 mg/L（比产量11 mg/L/OD），而30°C时为1200 mg/L（比产量8 mg/L/OD）。200 L发酵中产量超过1500 mg/L。
研究结论
开发了一种适合放大到立方米级别的补料分批发酵工艺，通过在繁殖期维持葡萄糖过量保证遗传稳定，通过乙醇补料和降温提高产量，最终在200 L规模获得超过1500 mg/L的SOD-PI融合蛋白，可作为重组人胰岛素原生产的前体。