Production of Catalytic Cells for Formaldehyde Production and Alcohol Oxidase by a Catabolite Repression-Insensitive Mutant of a Methanol Yeast, Candida boidinii A5
- 作者
- Yoshiki Tani, Tohru Sawai, Yasuyoshi Sakai
- 单位
- Research Center for Cell and Tissue Culture, Kyoto University; Department of Agricultural Chemistry, Faculty of Agriculture, Kyoto University
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（1987）
- DOI
- 10.1002/bit.260320910
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
甲醇酵母利用甲醇生长时细胞产率低，而添加葡萄糖虽可提高细胞产率但会通过分解代谢物阻遏抑制醇氧化酶合成，导致甲醛生产催化活性下降。需要获得既高产又保持高醇氧化酶活性的菌株和培养策略。
研究策略
筛选分解代谢物阻遏不敏感突变株ADU-15，并在碳限制恒化培养条件下，以葡萄糖-甲醇混合底物进行培养，系统优化葡萄糖浓度和稀释率，比较亲株与突变株的细胞产率、醇氧化酶活性和甲醛生产力。
核心内容
针对甲醇酵母利用甲醇生长时细胞产率低、而添加葡萄糖会阻遏醇氧化酶合成的问题，该研究筛选出分解代谢物阻遏不敏感的突变株Candida boidinii ADU-15，并在碳限制恒化培养条件下采用葡萄糖-甲醇混合底物进行系统优化。结果显示，突变株在0.3%葡萄糖-0.3%甲醇混合底物、稀释率0.075 h⁻¹时，醇氧化酶活性为0.58 U/mg cells，甲醛产量达900 mM，与甲醇单一底物培养相当；而单葡萄糖培养时其醇氧化酶活性为亲株的5倍。进一步优化后，突变株在1.0%葡萄糖-0.4%甲醇、稀释率0.10 h⁻¹时醇氧化酶生产率达0.33 U/mL·h，比亲株同条件提高1.3倍，较甲醇单一底物培养提高5.1倍；在0.6%葡萄糖-0.4%甲醇条件下，细胞生产率达0.430 mg/mL·h，为亲株甲醇单一底物培养的3.8倍，同时保持高产甲醛能力。该策略有效解除了葡萄糖阻遏，同步提升了细胞产率与醇氧化酶活性，为工业制备甲醛生产用催化细胞提供了可行方案。
创新点
1. 获得一株分解代谢物阻遏不敏感突变株Candida boidinii ADU-15，在葡萄糖存在下仍能合成醇氧化酶；2. 在恒化培养混合底物条件下，突变株在更高葡萄糖浓度（0.6%）和更高稀释率（0.10 h^-1）下仍保持最大醇氧化酶活性；3. 与亲株甲醇单一底物培养相比，醇氧化酶生产率提高5.0倍，甲醛催化细胞生产率提高3.8倍。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Candida boidinii A5 | 甲醇氧化途径 | — | Alcohol oxidase | 催化 | 野生型亲株，甲醇单一底物培养时具有最大醇氧化酶活性（0.58 U/mg cells）和甲醛生产力（900 mM）。 |
| Candida boidinii A5 突变株 ADU-15 | 甲醇氧化途径 | — | Alcohol oxidase | 催化 | 分解代谢物阻遏不敏感突变株，在葡萄糖存在下仍能合成醇氧化酶，混合底物恒化培养中保持高活性。 |
关键发现
- 突变株ADU-15在0.3%葡萄糖-0.3%甲醇混合底物恒化培养（稀释率0.075 h^-1）时，醇氧化酶活性为0.58 U/mg cells，甲醛产量900 mM，与甲醇单一底物培养相当
- 而亲株在同样条件下醇氧化酶活性为0.54 U/mg cells，甲醛840 mM。在0.3%单葡萄糖培养时，突变株醇氧化酶活性0.10 U/mg cells，为亲株（0.02）的5倍。优化培养条件后，突变株在1.0%葡萄糖-0.4%甲醇、稀释率0.10 h^-1时达到最大醇氧化酶生产率0.33 U/mL h，比亲株同条件高1.3倍，比甲醇单一底物培养（亲株0.065 U/mL h）提高5.1倍。在0.6%葡萄糖-0.4%甲醇、稀释率0.10 h^-1时，突变株细胞生产率0.430 mg/mL h，同时保持甲醛产量900 mM和醇氧化酶0.58 U/mg cells，此细胞产率是亲株甲醇单一底物培养（0.112 mg/mL h）的3.8倍。
研究结论
通过获得分解代谢物阻遏不敏感突变株ADU-15并采用葡萄糖-甲醇混合底物恒化培养，有效克服了葡萄糖对醇氧化酶合成的阻遏，同时提高了细胞产率和醇氧化酶活性，显著提升了甲醛生产用催化细胞的生产效率，为工业制备醇氧化酶和催化细胞提供了可行方案。