Combinatorial pathway optimization in Escherichia coli by directed co-evolution of rate-limiting enzymes and modular pathway engineering
- 作者
- Xiaomei Lv, Jiali Gu, Fan Wang, Wenping Xie, Min Liu, Lidan Ye, Hongwei Yu
- 单位
- Institute of Bioengineering, College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University; College of Life Sciences, Huzhou University
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2017）
- DOI
- 10.1002/bit.26034
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
微生物异源生物合成效率受限于途径酶活性不足和代谢中间体利用不平衡，导致目标产物产量低。
研究策略
整合多限速酶（DXS/DXR/IDI）的定向共进化与模块化途径工程（启动子操纵），同时改善途径内和途径间的代谢平衡。
研究路线图
核心内容
针对大肠杆菌异源合成异戊二烯效率低的问题，该研究将限速酶的定向共进化与模块化途径工程相结合，系统优化了MEP途径。首先，以番茄红素为颜色指示，建立高通量筛选方法，对MEP途径中三个限速酶DXS、DXR和IDI进行定向共进化，获得正突变组合dxs/dxr/idi-1-6，使番茄红素产量由0.36 mg/L提升至0.65 mg/L，提高80%，异戊二烯产量由3.71 mg/L提升至5.96 mg/L，提高60%。在此基础上，进一步对上下游模块进行启动子工程，通过优化P_Trc与P_Ara启动子组合及诱导剂浓度（0.02 mM IPTG和5 mM阿拉伯糖），最终使异戊二烯产量达到17.5 mg/L，相比仅蛋白工程菌株提高2.94倍，相比含野生型酶的对照提高4.72倍。该结果表明，限速酶定向共进化与模块化启动子工程的组合策略可同时改善途径内酶活与途径间代谢平衡，有效提升异戊二烯合成效率，且该策略可推广至其他异戊二烯类化合物及天然产物的生物合成优化。
创新点
开发了基于番茄红素颜色指示的高通量筛选方法用于DXS/DXR/IDI的定向共进化；将蛋白工程与模块化启动子工程相结合，实现异戊二烯合成途径的整体优化。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | MEP pathway | dxs | DXS | 催化 | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶，MEP途径主要限速酶 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MEP pathway | dxr | DXR | 催化 | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶，MEP途径限速酶 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MEP pathway | idi | IDI | 催化 | 异戊烯基二磷酸异构酶，调节IPP和DMAPP平衡 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异戊二烯合成途径（下游模块） | ispS | ISPS | 催化 | 异戊二烯合酶，催化DMAPP生成异戊二烯 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 番茄红素合成途径（筛选报告） | crtE | CrtE | 催化 | GGPP合酶，用于番茄红素筛选报告途径 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 番茄红素合成途径（筛选报告） | crtB | CrtB | 催化 | 八氢番茄红素合酶，用于番茄红素筛选报告途径 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 番茄红素合成途径（筛选报告） | crtI | CrtI | 催化 | 八氢番茄红素脱氢酶，用于番茄红素筛选报告途径 |
关键发现
- 通过定向共进化获得正突变体dxs/dxr/idi-1-6，使番茄红素产量提高80%（0.65 mg/L vs
- 36 mg/L），异戊二烯产量提高60%（5.96 mg/L vs
- 71 mg/L）；进一步通过模块化途径工程（启动子P_Trc和P_Ara组合，0.02 mM IPTG和5 mM阿拉伯糖诱导），最高异戊二烯产量达17.5 mg/L，比仅蛋白工程菌株（5.96 mg/L）提高2.94倍，比含野生型酶的对照菌株（3.71 mg/L）提高4.72倍。
研究结论
将多限速酶定向共进化与模块化途径工程相结合，能有效提高异戊二烯的微生物合成效率，该组合策略可推广到其他异戊二烯类化合物及天然产物的生物合成优化。