Probing the Role of the DXDD Motif in Class II Diterpene Cyclases
- 作者
- Sladjana Prisic, Jianjun Xu, Robert M. Coates, Reuben J. Peters
- 杂志
- ChemBioChem（2007）
- DOI
- 10.1002/cbic.200700045
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
探究II类二萜环化酶中DXDD基序的精确催化作用，特别是各天冬氨酸残基是否通过类似三萜环化酶（SHC）的机制质子化GGPP末端C=C双键。
研究策略
采用位点定向突变（D379A和D380A）结合环氧底物类似物（±）-14,15-氧化GGPP（oxidoGGPP），对野生型和突变体rAtCPS进行动力学分析，比较其催化GGPP和oxidoGGPP的活性差异。
核心内容
该研究通过位点定向突变结合环氧底物类似物（±）-14,15-氧化GGPP，系统探究了II类二萜环化酶rAtCPS中DXDD基序的催化机制。动力学分析显示，突变D379或D380均导致天然底物GGPP环化活性大幅下降，其中D379A突变体活性降低超过1000倍，D380A降低约3000倍，说明两个天冬氨酸残基均不可或缺。利用oxidoGGPP作为末端双键质子化的替代底物，发现D380A突变体活性仅降低约40倍，而D379A降低超过1000000倍，这直接证明DXDD基序中最后一个天冬氨酸（D380）负责激活中间天冬氨酸（D379）以质子化GGPP的C14,15双键。值得注意的是，D379A突变体将oxidoGGPP转化为3β-羟基-ent-CPP，而野生型和D380A主要生成3α-羟基产物，表明第一个天冬氨酸可能在特定条件下发挥替代催化作用。该结果揭示II类二萜环化酶与三萜环化酶SHC的DXDD基序功能高度一致，支持两类酶可能存在远距离结构同源性，同时证明oxidoGGPP是研究此类酶催化机制的有效工具。
创新点
首次利用oxidoGGPP底物类似物直接探测class II二萜环化酶DXDD基序的功能；证明DXDD基序中最后一个天冬氨酸（D380）对激活中间天冬氨酸（D379）以质子化末端C=C双键至关重要；发现D379A突变体对oxidoGGPP产生不同立体构型产物，提示第一个天冬氨酸可能替代催化。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli C41(DE3) | 二萜类化合物生物合成（GGPP环化生成ent-CPP） | AtCPS | rAtCPS (recombinant pseudomature ent-copalyl diphosphate synthase) | 催化 | 研究DXDD基序的功能；包括野生型及D379A、D380A突变体 |
关键发现
- 野生型rAtCPS对GGPP的Vobs=1.2±0.1 s⁻¹，Km=2.9±0.8 μM
- D379A突变体Vobs=(7.1±0.5)×10⁻⁸ s⁻¹（>1000倍降低），D380A突变体Vobs=(4.1±1.7)×10⁻⁴ s⁻¹（约3000倍降低）。对oxidoGGPP，野生型Vobs=0.67±0.09 s⁻¹，Km=1.7±0.6 μM
- D379A Vobs=(7.7±0.3)×10⁻⁷ s⁻¹（≥1000000倍降低），D380A Vobs=0.017±0.003 s⁻¹（约40倍降低）。15-aza-GGPP对野生型rAtCPS的IC50=11±3 nM。D379A突变体对oxidoGGPP生成3β-羟基-ent-CPP为主要产物（Vobs=(2.9±0.1)×10⁻⁶ s⁻¹），而野生型和D380A主要生成3α-羟基-ent-CPP。
研究结论
II类二萜环化酶的DXDD基序与三萜环化酶SHC的DXDD基序功能相同：最后一个天冬氨酸激活中间天冬氨酸以质子化末端C=C双键（此处为GGPP的C14,15双键）。结果支持这两类酶可能存在远距离结构同源性，oxidoGGPP可作为研究class II二萜环化酶催化机制的有效工具。