Identification of Bacterial Carotenoid Cleavage Dioxygenase Homologues That Cleave the Interphenyl α,β Double Bond of Stilbene Derivatives via a Monooxygenase Reaction
- 作者
- Erinn K. Marasco, Claudia Schmidt-Dannert
- 杂志
- ChemBioChem（2008）
- DOI
- 10.1002/cbic.200700724
- 所属领域
- 酶学与微生物学
- 关键词
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解决的核心问题
调查细菌中类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCO）同源物的分布与功能，鉴定非类胡萝卜素底物的CCO同源酶，并阐明其氧化裂解反应机制（单加氧酶还是双加氧酶）。
研究策略
通过基因组BLAST搜索鉴定细菌CCO同源物，克隆并在大肠杆菌中异源表达；利用体内共表达类胡萝卜素或二苯乙烯合成途径的菌株筛选裂解活性，并通过体外酶活测定和18O同位素标记实验解析底物特异性和反应机制。
核心内容
该研究通过基因组BLAST搜索鉴定细菌中类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCO）同源物的分布，并克隆多个候选基因在大肠杆菌中异源表达，以筛选非类胡萝卜素底物的裂解活性。结果显示，来自Novosphingobium aromaticivorans的NOV1和NOV2能够高效裂解二苯乙烯类化合物，体内16小时内将白藜芦醇完全降解，生成4-羟基苯甲醛和3,5-二羟基苯甲醛；体外实验中，1 mM白藜芦醇在20分钟内即被完全裂解，而1 mM piceatannol在60分钟内完全裂解，但对rhapontigenin和rhaponticin的活性较低。18O同位素标记实验揭示，分子氧被特异引入其中一个醛产物，4-羟基苯甲醛的18O标记率超过69%，而3,5-二羟基苯甲醛在18O-水实验中标记率达92.9%，证明该裂解反应实为单加氧酶机制而非双加氧酶机制。此外，来自Bradyrhizobium的BRA-J和BRA-S对法尼醇表现出氧化活性，但不裂解类胡萝卜素或二苯乙烯。该研究首次发现CCO家族中作用于二苯乙烯底物的酶，扩展了该家族的非类胡萝卜素底物范围，并揭示了新的单加氧酶催化机制，对理解CCO酶的底物多样性和反应机理具有重要意义。
创新点
首次发现Novosphingobium aromaticivorans中的CCO同源酶NOV1/NOV2能够裂解二苯乙烯类化合物（如白藜芦醇），并通过18O标记实验证明该裂解反应是单加氧酶机制，而非此前认为的双加氧酶机制。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3)（异源表达宿主） | 异源蛋白表达 | NOV1 | NOV1 (YP_496081) | 催化 | 从Novosphingobium aromaticivorans克隆，用于表达纯化，体外裂解白藜芦醇等二苯乙烯 |
| Escherichia coli BL21(DE3)（异源表达宿主） | 异源蛋白表达 | NOV2 | NOV2 (YP_498079) | 催化 | 从Novosphingobium aromaticivorans克隆，用于18O标记实验，证明单加氧酶机制 |
| Escherichia coli BW27784（体内底物合成宿主） | 二苯乙烯生物合成 | 4CL (来自拟南芥), STS (来自花生) | 4-香豆酰辅酶A连接酶, 二苯乙烯合酶 | 催化 | 用于体内合成白藜芦醇、松木素等二苯乙烯底物，与NOV/BRA共表达筛选裂解活性 |
| Escherichia coli JM109（类胡萝卜素合成宿主） | 类胡萝卜素生物合成 | crtE, crtB, crtI, crtY, crtX | CrtE, CrtB, CrtI, CrtY, CrtX | 催化 | 用于体内合成β-胡萝卜素、玉米黄质等，测试NOV/BRA是否具有类胡萝卜素裂解活性（结果为阴性） |
| Bradyrhizobium japonicum USDA110（基因来源） | 法尼醇氧化（推测） | BRA-J | BRA-J (NP_772430) | 催化 | 不裂解二苯乙烯或类胡萝卜素，对法尼醇有活性，产物结构未定 |
| Bradyrhizobium sp. BTAi1（基因来源） | 法尼醇氧化（推测） | BRA-S | BRA-S | 催化 | 不裂解二苯乙烯或类胡萝卜素，对法尼醇有活性，产物结构未定 |
关键发现
- NOV1和NOV2在体内16 h内将白藜芦醇完全降解，产生4-羟基苯甲醛和3,5-二羟基苯甲醛；体外实验中，1 mM（68.5 μg）白藜芦醇在20 min内被完全裂解，1 mM（73.3 μg）piceatannol在60 min内完全裂解，1 mM（77.4 μg）rhapontigenin和rhaponticin在60 min后仅达到20%裂解。
- 18O2标记实验中，4-羟基苯甲醛的18O标记率超过69%，而3,5-二羟基苯甲醛基本未标记（约65%未标记）；在18O-水实验中，3,5-二羟基苯甲醛的标记率达92.9%，4-羟基苯甲醛约90%未标记，表明分子氧特异引入其中一个醛产物，呈单加氧酶机制。
- 纯化后的酶活损失超过75%，纯化蛋白的裂解速率比粗酶液约低5倍。
- BRA-J和BRA-S对法尼醇表现出活性，产生疑似加双氧的衍生物（m/z 258，甲醇加合物m/z 290），但结构未确定。
- NOV1与Sphingomonas的SPA1/SPA3序列同一性为55%/56%，NOV2与它们为37-38%；NOV1与NOV2之间同一性36%。
研究结论
NOV1和NOV2是二苯乙烯裂解加氧酶，能特异性裂解4'位有含氧取代基的二苯乙烯的α,β双键，且通过单加氧酶机制将分子氧引入一个醛产物；BRA-J和BRA-S不裂解类胡萝卜素或二苯乙烯，但可能参与法尼醇氧化。研究扩展了CCO家族的非类胡萝卜素底物范围，并揭示该家族可能存在新的催化机制。