pH regulation is a major determinant in expression of a fungal penicillin biosynthetic gene
- 作者
- Eduardo A. Espeso, Joan Tilburn, Herbert N. Arst, Jr, Miguel A. Penalva
- 单位
- Centro de Investigaciones Biológicas del CSIC, Velázquez 144, Madrid 28006, Spain; Department of Infectious Diseases and Bacteriology, Royal Postgraduate Medical School, Hammersmith Hospital, Ducane Road, London W12 ONN, UK
- 杂志
- EMBO Journal（1993）
- DOI
- 10.1002/j.1460-2075.1993.tb06072.x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析pH调节系统对真菌青霉素生物合成基因ipnA表达的调控作用，以及碳分解代谢物阻遏与pH调节之间的相互关系。
研究策略
结合体内外实验：通过DNase I足迹分析鉴定CreA结合位点，利用反向遗传学精确删除该位点；通过Northern blot分析不同碳源和pH条件下ipnA转录水平；利用pacC和pal突变体研究pH调控；测量外部pH和青霉素产量以关联调控机制。
核心内容
该研究以构巢曲霉青霉素生物合成关键基因ipnA为对象，系统解析了pH调节与碳分解代谢物阻遏对其表达的调控机制。通过DNase I足迹分析鉴定出启动子中29 bp的CreA结合位点，反向遗传学删除该位点并不影响蔗糖对ipnA的阻遏，说明存在独立于creA的第二套碳阻遏机制。Northern blot与产量测定显示，含100 mM Na2HPO4的3%蔗糖培养基（初始pH 8.0）中ipnA转录完全去阻遏且青霉素产量增加；转移实验中pH 7.6较pH 5.0产量更高，转录在pH 6.2以上随pH升高而增强。进一步发现所有去阻遏碳源使外部碱化，而阻遏碳源使外部酸化；pacC功能获得型突变在蔗糖中部分去阻遏ipnA并提高产量，而pal突变不影响乳糖引起的去阻遏。结果表明外部碱性pH经pacC介导的调控绕过碳阻遏，是触发青霉素生物合成的生理信号，pH调节与碳代谢阻遏机制独立但通常协同决定ipnA表达水平。
创新点
1. 发现外部碱性pH可绕过碳阻遏，上调ipnA表达；2. 证明青霉素合成存在不依赖creA的第二套碳分解代谢物阻遏机制；3. 提出外部碱性pH是触发青霉素生物合成的生理信号。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus nidulans | 青霉素生物合成 | ipnA | isopenicillin N synthetase | 催化 | 编码异青霉素N合酶，青霉素途径关键酶，受pH和碳源双重调控 |
| Aspergillus nidulans | pH调控网络 | pacC | PacC | 调控 | 宽域pH调控基因，编码C2H2锌指转录因子，碱性pH下激活靶基因表达 |
| Aspergillus nidulans | 碳代谢调控 | creA | CreA | 调控 | 碳分解代谢物阻遏的转录阻遏因子，但ipnA转录不依赖其直接调控 |
| Aspergillus nidulans | pH信号传导 | palA, palB, palC, palE, palF | PalA/B/C/E/F | 调控 | pal基因突变模拟酸性pH生长表型，参与pH信号传导效应分子的合成 |
关键发现
- 在含100 mM Na2HPO4的3%蔗糖培养基中（初始pH
- 0），ipnA转录完全去阻遏，且青霉素产量增加
- 转移实验中，pH
- 6较pH
- 0产生更高青霉素产量，且ipnA转录在pH
- 2以上随pH升高而增强
- 乙酸（100 mM）为碳源时ipnA转录水平高于乳糖，而甘油（1%）抑制ipnA转录并几乎完全抑制青霉素产生
- 精确删除ipnA启动子中29 bp的CreA体外结合位点（含两个近consensus序列）不影响蔗糖阻遏
- pacC gain-of-function突变（如pacC11、pacC5、pacC202、pacC14、pacC203）在3%蔗糖中部分去阻遏ipnA转录并提高青霉素产量
- palA1、palB7、palF15突变不影响乳糖引起的ipnA去阻遏
- 外部酸性pH（缓冲至pH
- 0-5.2）不阻止乳糖引起的ipnA去阻遏
- 所有去阻遏碳源（乳糖、0.1%葡萄糖、0.1%果糖、1%阿拉伯糖、100 mM乙酸）使外部碱化，所有阻遏碳源（3%蔗糖、1%葡萄糖、1%甘油）使外部酸化。
研究结论
pH调节是青霉素生物合成基因ipnA表达的主要决定因素，外部碱性pH通过pacC介导的调控绕过碳阻遏；碳分解代谢物阻遏存在独立于creA的第二机制，且与pH调节机制独立但通常协同作用，外部碱性环境是触发青霉素生物合成的生理信号。