高级醇 · 代谢工程文献库

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Regulation of thiamine synthesis in Saccharomyces cerevisiae for improved pyruvate production

作者
Guoqiang Xu, Qiang Hua, Ningjun Duan, Liming Liu, Jian Chen
单位
State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University; State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology; Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University
杂志
Yeast（2012）
DOI
10.1002/yea.2902
所属领域
代谢工程
关键词
Saccharomyces cerevisiaeTHI2pyruvatethiamine synthesis
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解决的核心问题

酿酒酵母天然积累丙酮酸很少，乙醇是主要碳流方向；如何在不破坏PDC基因的前提下提高丙酮酸产量并减少乙醇副产物

研究策略

通过敲除硫胺素合成调控基因THI2或THI3，降低硫胺素依赖性PDC活性，并优化外加硫胺素浓度和碳氮比，从而将碳流从乙醇转向丙酮酸

研究路线图

100%
问题：酿酒酵母积累丙酮酸少，乙醇为主碳流，需提高丙酮酸产量并减少乙醇副产物
策略：敲除硫胺素合成调控基因（THI2 / THI3），降低PDC活性，优化硫胺素与碳氮比，将碳流由乙醇转向丙酮酸
关键改造①：敲除THI2正调控因子，降低THI基因表达，减少ThDP供给，抑制PDC活性
关键改造②：敲除THI3全局调控因子，影响所有硫胺素调控基因表达
关键改造③：优化外加硫胺素浓度（0.04 μM）与碳氮比（C:N=35:2）
结果①：THI2/THI3敲除后丙酮酸产量提高3.12倍/2.18倍，乙醇降低89.9%/81.0%
结果②：最优C:N=35:2条件下，96 h丙酮酸达8.21 g/L（提高9.0倍），乙醇降低58.06%
结果③：THI2缺失48 h PDC比活力下降67.0%，0.04 μM硫胺素下PDC活性回升10.5%，碳流约16.2%由乙醇转向丙酮酸
结论：调控硫胺素合成可有效提高酿酒酵母丙酮酸产量并降低乙醇副产物，为羧酸类产品提供前体丙酮酸，替代PDC直接敲除的新策略
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核心内容

该研究以酿酒酵母FMME-002为对象，通过调控硫胺素合成而非直接敲除丙酮酸脱羧酶（PDC）基因，将碳流从乙醇转向丙酮酸。研究者分别敲除硫胺素合成调控基因THI2和THI3，降低硫胺素依赖性PDC活性，并进一步优化外加硫胺素浓度及碳氮比。结果显示，敲除THI2和THI3后丙酮酸产量分别提高3.12倍和2.18倍，乙醇分别降低89.9%和81.0%。在最优条件（外加0.04 μM硫胺素、碳氮比35:2、96 h）下，THI2缺失菌株丙酮酸产量达8.21 g/L，较亲本提高9.0倍，乙醇降至2.21 g/L，降低58.06%。机理分析表明，THI2缺失使PDC比活力下降67.0%，外加硫胺素可部分恢复其活力，最终约16.2%的碳流由乙醇转向丙酮酸。该策略避免了直接敲除PDC带来的生长缺陷，为通过前体丙酮酸生产羧酸类产品提供了可行途径。

创新点

首次提出通过调控硫胺素合成而非直接敲除PDC来提高丙酮酸产量，避免生长缺陷；系统评估THI2和THI3缺失的影响，并确证THI2缺失的内在效应

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Saccharomyces cerevisiae FMME-002 硫胺素合成与丙酮酸代谢 THI2 — 调控 硫胺素合成正调控因子，敲除后降低THI基因表达，减少ThDP供给
Saccharomyces cerevisiae FMME-002 硫胺素合成与丙酮酸代谢 THI3 — 调控 硫胺素合成全局调控因子，敲除后影响所有硫胺素调控基因表达
Saccharomyces cerevisiae FMME-002 乙醇发酵 PDC1/PDC5 丙酮酸脱羧酶 (PDC) 催化 ThDP依赖酶，催化丙酮酸不可逆转化为乙醛，是乙醇合成的关键酶；THI2缺失导致其活性降低67%
Saccharomyces cerevisiae FMME-002 丙酮酸代谢 — 丙酮酸脱氢酶复合体 (PDH) 催化 ThDP依赖，催化丙酮酸氧化脱羧为乙酰-CoA；THI2缺失和亚适量硫胺素使其活性相对降低

关键发现

  1. 敲除THI2和THI3后丙酮酸产量分别提高3.12倍和2.18倍，乙醇分别降低89.9%和81.0%
  2. FMME-002ΔTHI2在添加0.04 μM硫胺素时36 h丙酮酸达3.82±0.14 g/L，乙醇4.57±0.27 g/L
  3. 最优C:N=35:2条件下96 h丙酮酸达8.21±0.30 g/L，乙醇降至2.21±0.24 g/L，较亲本丙酮酸提高9.0倍，乙醇降低58.06%
  4. THI2缺失48 h时PDC比活力下降67.0%，添加0.04 μM硫胺素后PDC活力回升10.5%
  5. 04 μM硫胺素条件下丙酮酸产率从0.022 mol/mol提高到0.335 mol/mol，乙醇产率从0.914 mol/mol降至0.766 mol/mol，约16.2%的碳流从乙醇转向丙酮酸

研究结论

通过调控硫胺素合成可有效提高酿酒酵母丙酮酸产量并降低乙醇副产物，为羧酸类产品生产提供前体丙酮酸，是一种替代PDC直接敲除的新策略