Terpenoid Secondary Metabolism in Arabidopsis thaliana: cDNA Cloning, Characterization, and Functional Expression of a Myrcene/(E)-β-Ocimene Synthase
- 作者
- Jörg Bohlmann, Diane Martin, Neil J. Oldham, Jonathan Gershenzon
- 单位
- Max Planck Institute for Chemical Ecology, Carl- Zeiss- Promenade 10, 07745 Jena, Germany
- 杂志
- Archives of Biochemistry and Biophysics（2000）
- DOI
- 10.1006/abbi.1999.1669
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
拟南芥尚未被报道产生萜类次生代谢物，但基因组中发现多个与次生代谢萜类合酶高度相似的序列，这些基因是否表达及其编码酶的生化功能未知。
研究策略
利用保守区域PCR从cDNA文库中扩增AtTPS03片段，以其为探针筛选茉莉酸诱导的cDNA文库获得AtTPS10全长cDNA；在E. coli中异源表达截去转运肽的蛋白，使用放射性标记底物测定酶活，结合GC-FID和GC-MS鉴定产物。
核心内容
该研究首次在拟南芥中功能鉴定了参与萜类次生代谢的单萜合酶AtTPS10。研究者通过保守区域PCR从cDNA文库中扩增片段，进而筛选茉莉酸诱导的cDNA文库获得全长cDNA，并在大肠杆菌中异源表达截去转运肽的重组蛋白，利用放射性标记底物结合GC-FID和GC-MS鉴定产物。结果显示，AtTPS10的开放阅读框长1665 bp，编码555个氨基酸，其重组酶以香叶基焦磷酸为底物时，酶活为0.5至1.0纳摩尔每小时，主要产物为β-月桂烯（占56%）和(E)-β-罗勒烯（占20%），另有少量环状单萜。该酶与AtTPS02和AtTPS03的序列同一性分别为52.6%和56.0%，归入TPSb亚家族。这一发现证明拟南芥基因组中TPSb亚家族基因确有表达，其萜类次生代谢可能具有未被认识的生态功能，且单萜合酶的功能分化在裸子与被子植物中独立发生。
创新点
首次在拟南芥中功能鉴定了参与次生代谢的单萜合酶，证明拟南芥存在表达TPSb亚家族基因并具有活跃的萜类次生代谢，且功能分化在裸子植物和被子植物中独立发生。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 单萜生物合成 | AtTPS10 | myrcene/(E)-β-ocimene synthase | 催化 | 异源表达截短转运肽的AtTPS10，催化GPP生成β-myrcene和(E)-β-ocimene及少量环状单萜 |
关键发现
- AtTPS10 cDNA开放阅读框为1665 bp，编码555个氨基酸
- 重组酶以GPP为底物时酶活为0.5-1.0 nmol/h（每100 ml培养物提取液）
- 主要产物为β-月桂烯（占56%）和(E)-β-罗勒烯（占20%），另有少量环状单萜各<5%（(−)-柠檬烯、(+)-柠檬烯、2-蒈烯、三环萜等）
- AtTPS10与AtTPS02和AtTPS03的相似性分别为62.0%和66.1%（同一性52.6%和56.0%）
- 基于序列归入TPSb亚家族。
研究结论
AtTPS10编码myrcene/(E)-β-ocimene合酶，是拟南芥中首个功能鉴定的次生代谢萜类合酶，表明拟南芥基因组中TPSb亚家族基因有表达，萜类次生代谢在该模式植物中可能具有未被认识的生态功能。