Functional Expression of Regiospecific Cytochrome P450 Limonene Hydroxylases from Mint (Mentha spp.) in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Christian Haudenschild, Michel Schalk, Frank Karp, Rodney Croteau
- 单位
- Institute of Biological Chemistry, Washington State University, Pullman, Washington 99164-6340
- 杂志
- Archives of Biochemistry and Biophysics（2000）
- DOI
- 10.1006/abbi.2000.1864
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
薄荷中区域特异性细胞色素P450柠檬烯羟化酶（C6和C3羟化酶）在天然植物中表达量低，难以进行结构-功能关系研究，需要建立合适的异源表达系统以获得足量重组蛋白用于研究底物结合和区域选择性机制。
研究策略
通过N端修饰（截短、替换牛17α-羟化酶N端、改变AT含量等）构建多个cDNA变体，分别利用pCWOri(+)载体在大肠杆菌JM109和pYeDP60载体在酿酒酵母WAT11U/WAT21U中表达，并建立膜蛋白增溶、纯化及与重组NADPH-细胞色素P450还原酶重构的方法，进行底物结合和产物分析。
核心内容
薄荷中区域特异性细胞色素P450柠檬烯羟化酶（C6与C3羟化酶）在天然植物中表达量低，限制了对其结构-功能关系的研究。本研究通过N端截短、替换牛17α-羟化酶N端及调整AT含量等修饰策略构建cDNA变体，分别利用pCWOri(+)载体在大肠杆菌JM109和pYeDP60载体在酿酒酵母WAT11U/WAT21U中实现功能性表达，并建立了膜蛋白增溶、纯化及与重组NADPH-细胞色素P450还原酶重构的方法。在大肠杆菌中，C6羟化酶表达量达350 nmol P450/L培养物，微体含量为810 pmol/mg蛋白，羟化活性为369 nmol/h/mg；C3羟化酶表达量达500 nmol/L，微体含量1400 pmol/mg，活性高达2260 nmol/h/mg。酵母微体中两种酶也获得较高活性，其中C6羟化酶比活达47.9 min⁻¹。纯化后的C6羟化酶比含量达15 nmol/mg，C3羟化酶达8.53 nmol/mg。底物结合常数测定显示C6羟化酶Kd为3.8 μM，C3羟化酶为0.66 μM。产物分析证实C6羟化酶>99%生成(-)-trans-香芹醇，C3羟化酶专一生成(-)-trans-异胡薄荷醇。该研究通过N端修饰成功获得足量重组蛋白，确认两种酶具有严格区域和立体选择性，为阐明P450选择性决定机制提供了高效工具。
创新点
首次在E. coli和S. cerevisiae中功能性表达了薄荷的C6和C3柠檬烯羟化酶；开发了N端修饰策略，获得高表达的P450酶；建立了从大肠杆菌膜中纯化和重构活性测定的完整流程；精确测定了两种羟化酶的底物解离常数和产物立体化学。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM109 | 薄荷单萜生物合成 | SM12 (CYP71D18) | Limonene-6-hydroxylase | 催化 | 催化(-)-柠檬烯C6位烯丙位羟基化，生成(-)-trans-香芹醇；通过N端替换牛17α-羟化酶N端获得高表达（S12-2-48） |
| Escherichia coli JM109 | 薄荷单萜生物合成 | PM2 (CYP71D15) | Limonene-3-hydroxylase | 催化 | 催化(-)-柠檬烯C3位烯丙位羟基化，生成(-)-trans-异胡薄荷醇；表达构体P2-2-48 |
| Escherichia coli JM109 | 薄荷单萜生物合成 | PM17 (CYP71D13) | Limonene-3-hydroxylase (isoform) | 催化 | 另一C3羟化酶同工酶，与PM2高度相似；表达构体P17-2-48 |
| Saccharomyces cerevisiae WAT11U/WAT21U | 薄荷单萜生物合成 | SM12 (CYP71D18) | Limonene-6-hydroxylase | 催化 | 全长或N端修饰形式均可在酵母中表达，微体直接用于活性测定 |
| Saccharomyces cerevisiae WAT11U/WAT21U | 薄荷单萜生物合成 | PM2, PM17 | Limonene-3-hydroxylase | 催化 | 未修饰全长形式在酵母中表达，虽含量低但比活较高 |
| Saccharomyces cerevisiae WAT11U/WAT21U | P450电子传递 | ATR1, ATR2 | NADPH-cytochrome P450 reductase | 能量供给 | 来自拟南芥，基因组整合于酵母CPR1位点，为P450提供还原力；两种还原酶均与薄荷羟化酶兼容 |
| Escherichia coli (in vitro reconstitution) | P450电子传递 | 薄荷NADPH-细胞色素P450还原酶基因 | NADPH-cytochrome P450 reductase (spearmint) | 能量供给 | 重组薄荷还原酶用于体外重构大肠杆菌膜中的羟化酶活性 |
关键发现
- 大肠杆菌中S12-2-48（C6羟化酶）表达量达350 nmol P450/L培养物，微体中P450含量为810 pmol/mg蛋白，羟化活性为369±15 nmol/h/mg蛋白，比活7.6±0.3 min-1
- P2-2-48（C3羟化酶）表达量500 nmol/L，微体含量1400 pmol/mg，活性2260±400 nmol/h/mg，比活26.9±4.7 min-1
- P17-2-48表达量265 nmol/L，微体含量420 pmol/mg，活性391±5 nmol/h/mg。酵母中S12-0-49在WAT11U微体P450含量527 pmol/mg，活性1510±41 nmol/h/mg，比活47.9±1.3 min-1
- P17-0-49在WAT11U中活性570±26 nmol/h/mg，比活143.8±6.2 min-1。纯化的C6羟化酶比含量达15 nmol/mg（收率20%），C3羟化酶（PM17版本）纯化后比含量8.53 nmol/mg（收率29%）。底物结合常数：C6羟化酶Kd=3.8±0.9 μM，C3羟化酶Kd=0.66±0.07 μM。产品分析显示C6羟化酶>99%生成(-)-trans-香芹醇，C3羟化酶专一生成(-)-trans-异胡薄荷醇。
研究结论
通过N端修饰成功在大肠杆菌和酵母中功能性表达了薄荷P450柠檬烯羟化酶，获得足量蛋白用于结构功能研究。C6羟化酶比活性低于C3羟化酶，两种酶均具有严格的区域选择性和立体选择性。大肠杆菌表达系统配合薄荷还原酶重构适用于体外研究，而酵母微体直接表达系统便于快速评价突变体，为阐明P450区域选择性决定因素提供了有效工具。