Enzymes for Synthetic Biology of Ambroxide-Related Diterpenoid Fragrance Compounds
- 作者
- Philipp Zerbe, Jörg Bohlmann
- 单位
- University of British Columbia; University of California at Davis
- DOI
- 10.1007/10_2015_308
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
如何利用合成生物学和代谢工程手段，通过植物二萜合酶及其生物合成途径生产龙涎香醚（ambroxide）相关二萜前体，替代传统依赖抹香鲸副产品或天然植物提取的有限资源。
研究策略
综述了基于转录组测序、代谢物分析和酶功能鉴定的多组学策略，挖掘植物二萜合酶和细胞色素P450，并通过模块化组合在微生物宿主中异源表达，重构sclareol、cis-abienol及二萜树脂酸等前体生物合成途径。
核心内容
龙涎香醚及其相关二萜类香料传统上依赖抹香鲸副产物或天然植物提取，资源十分有限。该综述系统梳理了利用合成生物学与代谢工程可持续生产此类前体的研究路径。核心策略是结合转录组测序、代谢物分析和酶功能鉴定等多组学手段，从植物中挖掘关键二萜合酶与细胞色素P450，并在大肠杆菌和酿酒酵母等微生物宿主中通过模块化组合异源重构生物合成途径。研究发现，工程大肠杆菌共表达来自鼠尾草的labda-13-en-8-ol二磷酸合酶（SsLPS）和香紫苏醇合酶（SsSCS），可实现香紫苏醇产量高达1.5 g/L；在酵母中，克里特岩蔷薇LPS与SsSCS共表达则获得约400 mg/L的产量。此外，胶冷杉中分离的双功能cis-abienol合酶AbCAS能直接催化GGPP生成cis-abienol，且该底物在树脂油中含量可达40%。细胞色素CYP720B4被证实为多底物多功能酶，可催化8种二萜底物的三步氧化。这些工作揭示了植物二萜合酶的平行进化机制与中间体“劫持”现象，证明微生物发酵平台在生产龙涎香醚前体方面具备产物纯度高、可扩展性强等优势，但宿主毒性和酶表达效率仍是产业化亟待解决的问题。
创新点
系统总结了双功能与单功能二萜合酶的平行进化机制；发现并表征了SsLPS/SsSCS、AbCAS、CYP720B4等关键酶；建立了微生物平台高效生产sclareol（大肠杆菌1.5 g/L、酵母约400 mg/L）和cis-abienol。
研究对象（14）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌 | sclareol生物合成 | SsLPS | labda-13-en-8-ol diphosphate synthase | 催化 | 来自鼠尾草（Salvia sclarea），类II二萜合酶，催化GGPP生成LPP，与SsSCS共表达生产sclareol |
| 大肠杆菌 | sclareol生物合成 | SsSCS | sclareol synthase | 催化 | 来自鼠尾草，类I二萜合酶，催化LPP生成sclareol；工程菌株产量达1.5 g/L |
| 酿酒酵母 | sclareol生物合成 | SsSCS | sclareol synthase | 催化 | 与C. creticus LPS共表达，sclareol产量约400 mg/L |
| 酿酒酵母 | sclareol生物合成 | CcLPS | copal-8-ol diphosphate synthase | 催化 | 来自岩蔷薇（Cistus creticus），催化GGPP生成copal-8-ol diphosphate，与SsSCS共表达 |
| 酿酒酵母 | cis-abienol生物合成 | NtABS | cis-abienol synthase | 催化 | 来自烟草（Nicotiana tabacum），类I二萜合酶，与CcLPS-Erg20融合蛋白共表达生产cis-abienol |
| 酿酒酵母 | cis-abienol生物合成 | CcLPS | copal-8-ol diphosphate synthase | 催化 | 与改造的Erg20p形成融合蛋白，提供LPP中间体 |
| 酿酒酵母 | cis-abienol生物合成 | Erg20p | FPP synthase (GGPP-producing variant) | 催化 | 酵母法呢基焦磷酸合酶变体，被改造为GGPP合酶以增强前体供给 |
| 胶冷杉（天然宿主） | cis-abienol生物合成 | AbCAS | cis-abienol synthase | 催化 | 来自胶冷杉（Abies balsamea），双功能类I/II二萜合酶，直接催化GGPP生成cis-abienol |
| 烟草（天然宿主） | cis-abienol生物合成 | NtLPS | LPP synthase | 催化 | 来自烟草，类II二萜合酶，催化GGPP生成LPP，与NtABS共同作用 |
| 酿酒酵母 | 二萜树脂酸（DRA）生物合成 | CYP720B4 | cytochrome P450 720B4 | 催化 | 来自北美云杉（Picea sitchensis），多功能多底物P450，催化二萜烯三步氧化为树脂酸；可氧化8种底物 |
| 酿酒酵母 | 二萜树脂酸（DRA）生物合成 | LAS | levopimaradiene/abietadiene synthase | 催化 | 来自多种针叶树，双功能类I/II二萜合酶，生成松香烷型二萜烯，与CYP720B4共表达 |
| 酿酒酵母 | 二萜树脂酸（DRA）生物合成 | ISO | isopimaradiene synthase | 催化 | 来自多种针叶树，生成海松烷型二萜烯，与CYP720B4共表达 |
| 大肠杆菌 | 二萜前体供给 | CrtE | GGPP synthase | 催化 | 细菌牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶，提高GGPP前体供给，用于sclareol生产 |
| 火炬松（天然宿主） | 二萜树脂酸（DRA）生物合成 | CYP720B1 | abietadienol/abietadienal oxidase | 催化 | 来自火炬松（Pinus taeda），与CYP720B4同属CYP720B家族，催化二萜烯氧化 |
关键发现
- 工程大肠杆菌共表达SsLPS和SsSCS可生产sclareol达1.5 g/L
- 工程酵母中C. creticus LPS与SsSCS共表达生产sclareol约400 mg/L
- 胶冷杉（Abies balsamea）树脂油中cis-abienol含量高达40%
- CYP720B4是多底物多功能P450，可催化8种二萜底物各自的三步氧化反应
- 发现AbCAS是首个能直接催化GGPP生成cis-abienol的双功能二萜合酶
- 松树单功能二萜合酶可“劫持”双功能酶产生的(+)–CPP中间体。
研究结论
植物二萜代谢基因和酶库结合模块化工程策略，为龙涎香醚前体（sclareol、cis-abienol、二萜树脂酸）的可持续生产提供了替代途径；微生物发酵平台在产物纯度、可扩展性和可控性方面具有优势，但宿主毒性、酶表达效率等问题仍待解决。