Cell Factories of Higher Fungi for Useful Metabolite Production
- 作者
- Hao Qin, Jun-Wei Xu, Jian-Hui Xiao, Ya-Jie Tang, Han Xiao, Jian-Jiang Zhong
- 杂志
- Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/10_2015_335
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
高等真菌产生的生物活性次级代谢物（如灵芝酸、虫草素等）产量低且化学合成困难，难以满足临床和市场需求，需要构建高效的高等真菌细胞工厂。
研究策略
综合运用多种遗传转化方法（PEG介导、电穿孔、农杆菌介导、REMI等）、基因过表达/沉默/敲除等遗传操作工具，结合基因组、转录组、蛋白质组和代谢组学分析来解析和改造代谢途径，并通过发酵优化提高目标代谢物产量。
核心内容
该研究系统综述了高等真菌细胞工厂的构建策略及其在有用代谢物生产中的应用。针对灵芝酸、虫草素等生物活性次级代谢物产量低且化学合成困难的问题，作者综合比较了PEG介导、电穿孔、农杆菌介导和REMI等多种遗传转化方法，并整合基因过表达、RNAi沉默、ku基因敲除介导的高效基因打靶等遗传操作工具，结合多组学分析和发酵优化来改造代谢途径。关键结果包括：过表达HMGR使灵芝酸含量提高至野生型的2倍，共沉默灵芝URA3和漆酶基因最高沉默率达81.9%，添加钙离子使灵芝酸总量提高3.7倍，在pH-shift和DO-shift集成补料发酵中灵芝酸产量达754.6 mg/L，洛伐他汀在平菇中最大产量达114.82 mg/L，较未优化高50倍。该工作表明高等真菌细胞工厂可显著提高有用代谢物产量，有望成为生产天然药物的有效平台，但目前研究水平仍落后于大肠杆菌和酵母等模式生物。
创新点
系统总结了高等真菌细胞工厂的构建策略，包括多种遗传转化方法的比较、利用同源或异源启动子进行过表达、RNAi基因沉默、基于ku基因敲除的高效基因打靶技术，以及组学指导的代谢工程和发酵过程优化。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Ganoderma lucidum | 灵芝酸生物合成（甲羟戊酸途径） | hmgr | HMG-CoA还原酶 | 催化 | 过表达使灵芝酸含量提高至野生型的2倍 |
| Ganoderma lucidum | 灵芝酸生物合成 | sqs | 鲨烯合酶 | 催化 | 过表达提高灵芝酸积累 |
| Ganoderma lucidum | 多糖生物合成 | pgm | 磷酸葡萄糖变位酶 | 催化 | 过表达提高多糖产量 |
| Ganoderma lucidum | 多糖生物合成 | ugp | UDP-葡萄糖焦磷酸化酶 | 催化 | 过表达提高多糖产量 |
| Ganoderma lucidum | — | sdhB | 琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白亚基 | 催化 | 作为选择标记，赋予萎锈灵抗性 |
| Ganoderma lucidum | — | URA3、漆酶基因 | 乳清酸核苷-5'-单磷酸脱羧酶、漆酶 | 催化 | 共沉默，最高沉默率81.9% |
| Hypholoma sublateritium | 克拉维酸和麦角甾醇生物合成 | erg1 | 鲨烯环氧酶 | 催化 | 过表达提高克拉维酸产量，沉默则降低 |
| Pleurotus ostreatus | β-葡聚糖生物合成 | β-葡聚糖合酶 | β-葡聚糖合酶 | 催化 | 启动子交换使产量提高32% |
| Phellinus igniarius | 黄酮和胞外多糖合成 | vgb | 透明颤菌血红蛋白 | 转运 | 总黄酮和胞外多糖产量分别达11.43 g/L和1.33 g/L |
| Schizophyllum commune | 基因打靶 | ku80 | Ku80 | 调控 | 敲除ku80提高同源重组效率，7/10转化子为基因敲除 |
| Ganoderma lucidum | 萜类生物合成 | CYP450家族基因 | 细胞色素P450单加氧酶 | 催化 | 基因组中鉴定出16个可能参与萜类合成的CYPs |
| Ganoderma lucidum | 灵芝酸生物合成 | 钙调磷酸酶信号通路 | 钙调磷酸酶 | 调控 | 钙离子通过钙调磷酸酶信号转导促进GA积累，总GA提高3.7倍 |
| Phanerochaete chrysosporium | 木质素降解 | mnp、lip、vp | 锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶、多功能过氧化物酶 | 催化 | 过表达三种过氧化物酶使产量提高4倍 |
关键发现
- PEG介导转化在平菇中每μg DNA每10^7原生质体可获得80-180个转化子
- 过表达HMGR使灵芝酸含量提高至野生型的2倍
- 通过启动子交换，平菇β-葡聚糖产量提高32%
- 共沉默灵芝中URA3和漆酶基因，最高沉默率达81.9%
- 添加钙离子使灵芝酸总量及GA-Mk、GA-S、GA-T、GA-Me分别提高3.7、2.6、3.2、4.5、3.8倍
- 在pH-shift和DO-shift集成补料发酵中灵芝酸产量达754.6 mg/L
- 洛伐他汀在平菇中最大产量达114.82 mg/L，较未优化高50倍
- 表达透明颤菌血红蛋白后，火木层孔菌总黄酮和胞外多糖产量分别达11.43 g/L和1.33 g/L
- 硫化菌最优条件下EPS产量达3.28 g/L。
研究结论
通过遗传改造和发酵优化，高等真菌细胞工厂可显著提高有用代谢物的产量，有望成为生产天然药物的有效平台，但目前研究水平仍落后于大肠杆菌和酵母，亟需更多研究投入。