Transformation of microcrystalline hydrocortisone by free and immobilized cells of Arthrobacter simplex
- 作者
- R. Vlahov, V. Pramatarova, G. Spassov, G. V. Suchodolskaya, K. A. Koshcheenko
- 单位
- Institute of Organic Chemistry, Bulgarian Academy of Sciences, 1113 Sofia, Bulgaria; Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, USSR Academy of Sciences, Moscow, USSR
- DOI
- 10.1007/BF00176520
- 所属领域
- 发酵工程
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解决的核心问题
确定Arthrobacter simplex游离和固定化细胞将微晶氢化可的松转化为泼尼松龙的最佳条件，实现95%转化率
研究策略
考察培养基组成（添加L-赖氨酸生物制品）、非离子表面活性剂（Tween、PEG、SPS-15）及外源电子受体（menadione）对Δ1-脱氢酶活性的影响，并比较游离细胞与不同载体（聚丙烯酰胺凝胶、卡拉胶、海藻酸钙）固定化细胞的转化性能
核心内容
本研究以Arthrobacter simplex ATCC 6946为宿主，系统优化了其将微晶氢化可的松转化为泼尼松龙的Δ1-脱氢工艺。通过调控培养基组成、添加非离子表面活性剂（SPS-15、Tween、PEG）及外源电子受体menadione，发现含L-赖氨酸生物制品的培养基2可使Δ1-脱氢酶比活提高约30%（0.018对0.011–0.013 μmol/mg cells·min），而在L-赖氨酸生物制品、SPS-15与menadione三者联用时，5–10 g/L底物浓度下4小时即可完全转化，产物含94%泼尼松龙和6%氢化可的松，一次重结晶后杂质降至3.5%，符合英国药典标准。此外，比较了游离细胞与聚丙烯酰胺凝胶（PAG）、卡拉胶、海藻酸钙固定化细胞的性能，其中PAG保留60–70%活性并达到94%转化率，但在menadione存在下酶活性快速衰减，提高menadione浓度至0.35 mM可使固定化细胞稳定性提升3倍。该组合策略显著缩短了反应时间并简化了产物纯化流程，为类固醇脱氢工业放大提供了可行方案，但固定化系统的长期稳定性仍需进一步优化。
创新点
发现L-赖氨酸生物制品与SPS-15、menadione组合可显著提高氢化可的松转化效率，在5-10 g/L底物浓度下实现94%转化，产品经一次重结晶符合英国药典标准；揭示了固定化细胞在menadione存在下酶活性快速下降的问题
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Arthrobacter simplex ATCC 6946 | 类固醇Δ1-脱氢途径 | — | Δ1-脱氢酶 | 催化 | 催化氢化可的松脱氢生成泼尼松龙 |
关键发现
- 培养基2（含L-赖氨酸生物制品）使Δ1-脱氢酶特异性提高约30%（0.018 vs 0.011-0.013 μmol/mg cells·min）
- 5 g/L氢化可的松转化8-10 h达到90%转化
- 加入0.025% menadione后60 min生成60%泼尼松龙（对照15%），完成时间提前5-6 h，但最终仍为90%泼尼松龙/10%氢化可的松
- 在L-赖氨酸生物制品+SPS-15+menadione组合下，5-10 g/L氢化可的松4 h内完全转化，产物含94%泼尼松龙和6%氢化可的松，重结晶后产品中氢化可的松含量3.5%
- 30 g/L时转化率为90%
- 聚丙烯酰胺凝胶固定化细胞保留60-70%活性，卡拉胶保留50-60%，海藻酸钙仅30%
- PAG固定化细胞在组合添加剂下可实现94%转化
- menadione浓度为0.35 mM时，固定化细胞在95%转化条件下稳定性提高3倍
研究结论
使用游离Arthrobacter simplex细胞，结合L-赖氨酸生物制品、SPS-15和menadione的组合，能够在5-10 g/L底物浓度下实现氢化可的松约94%至95%转化为泼尼松龙，且产品易纯化；固定化细胞（尤其是PAG）可达到类似转化率，但在menadione存在下酶活性下降快，需进一步优化固定化系统稳定性。