The Bacillus subtilis menCD promoter is responsive to extracellular pH
- 作者
- Kevin F. Hill, John P. Mueller, Harry W. Taher
- 单位
- Department of Microbiology and Immunology, Albany Medical College, Albany, NY 12208, USA
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（1990）
- DOI
- 10.1007/BF00249005
- 所属领域
- 微生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解析枯草芽孢杆菌menCD启动子响应细胞外pH的调控机制，理解甲基萘醌生物合成基因在环境酸化和孢子形成过程中的表达调控。
研究策略
构建menCD'-lacZ翻译融合报告基因，在野生型和TCA循环突变株（citB、citK、sdhC）中监测β-半乳糖苷酶活性，同时测量培养基pH变化，并通过MOPS缓冲至pH 7.2或MES缓冲至pH 5.5来调控pH，分析启动子活性与pH的关联。
核心内容
该研究以枯草芽孢杆菌menCD启动子为对象，通过构建menCD'-lacZ翻译融合报告系统，在野生型及citB、citK、sdhC等TCA循环突变株中监测β-半乳糖苷酶活性，并结合酸碱缓冲策略，解析了该启动子响应细胞外pH的调控机制。结果发现，在含0.1%葡萄糖的未缓冲培养基中，野生型menCD启动子活性在指数生长结束后约0.5小时达到峰值，随后迅速衰减，至T4.0时降至最大活性的10%以下，而培养基pH先降至5.7再回升至7.0；在TCA循环突变株中，pH持续维持5.7，启动子激活也持续保持高水平。通过将培养基缓冲至pH 7.2可消除或显著降低启动子的增强激活，而向野生型培养物中加入MES缓冲至pH 5.5则能使启动子活性维持在高水平。酶稳定性实验排除了降解速率差异的干扰，证明细胞外酸性pH是激活menCD启动子的直接信号。这一发现首次报道了枯草芽孢杆菌中受细胞外pH调控的启动子，揭示了低pH条件下细菌通过增加膜上甲基萘醌浓度以维持质子泵出和胞内pH稳态的潜在适应性机制。
创新点
首次报道枯草芽孢杆菌中受细胞外pH调控的启动子（menCD启动子）；利用TCA循环突变株和酸碱缓冲策略证明细胞外酸性pH是激活menCD启动子的直接信号，而非代谢中间产物。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus subtilis | 甲基萘醌生物合成 | menCD启动子 | — | 调控 | 受细胞外酸性pH激活的σA依赖性启动子，控制menC和menD的转录 |
| Bacillus subtilis | 甲基萘醌生物合成 | menC | — | 催化 | 编码邻琥珀酰苯甲酸-CoA合成酶，参与甲基萘醌合成 |
| Bacillus subtilis | 甲基萘醌生物合成 | menD | — | 催化 | 编码2-琥珀酰-5-烯醇丙酮酰-6-羟基-3-环己烯-1-羧酸合成酶等，参与甲基萘醌合成 |
| Bacillus subtilis | 三羧酸循环 | citB | — | 催化 | 编码乌头酸酶；突变导致培养基持续酸化及menCD启动子持续激活 |
| Bacillus subtilis | 三羧酸循环 | citK | — | 催化 | 编码2-酮戊二酸脱氢酶；突变导致培养基持续酸化及menCD启动子持续激活 |
| Bacillus subtilis | 三羧酸循环 | sdhC | — | 催化 | 编码琥珀酸脱氢酶；突变导致培养基持续酸化及menCD启动子持续激活 |
关键发现
- 在含0.1%葡萄糖的未缓冲2×NS培养基中，野生型menCD启动子活性（β-半乳糖苷酶报告）在指数生长结束后约0.5小时（T0.5）达到峰值，至T4.0时降至最大活性的<10%；培养基pH在T0.25降至5.7，随后回升至7.0。在citK、citB、sdhC等TCA循环突变株中，pH持续保持5.7，启动子激活持续维持高水平而不衰减。将培养基缓冲至pH
- 2可消除或显著降低启动子的增强激活；对cit+菌株在T0.25时加入0.1 M MES缓冲至pH
- 5，可使启动子活性维持在高水平，而未缓冲对照正常下降（图4）。酶稳定性衰减速率在酸性缓冲与未缓冲条件间的差异不足以解释活性差异（T0时0.55 U/min；T1时0.56 vs
- 38；T2时0.25 vs
- 24 U/min）。
研究结论
细胞外pH下降是激活menCD启动子的关键信号，该信号可通过糖酵解产物积累或TCA循环阻滞产生，也可用酸性缓冲直接模拟；中性缓冲可逆转激活。机制可能与低pH下细菌需增加膜上甲基萘醌（MK）浓度以维持质子泵出和胞内pH稳态有关，或与羧酸在酸性条件下更易进入细胞有关。