Functional assignment of Erwinia herbicola Eho10 carotenoid genes expressed in Escherichia coli
- 作者
- B. Hundle, M. Alberti, V. Nievelstein, P. Beyer, H. Kleinig, G. A. Armstrong, D. H. Burke, J. E. Hearst
- 杂志
- Molecular and General Genetics（1994）
- DOI
- 10.1007/BF00302252
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
确定Erwinia herbicola Eho10类胡萝卜素基因簇中各开放阅读框的功能，以及从法尼基焦磷酸（FPP）到玉米黄质二葡萄糖苷的完整类胡萝卜素生物合成途径所需的基因组成。
研究策略
对携带完整类胡萝卜素基因簇的质粒pPL376进行DNA测序，通过缺失突变、插入突变和移码突变分别破坏各开放阅读框，利用HPLC和吸收光谱分析突变株积累的类胡萝卜素中间体，结合蛋白质序列同源性比对，对六个crt基因进行功能分配。
核心内容
该研究对Erwinia herbicola Eho10的类胡萝卜素基因簇进行了系统功能解析。通过DNA测序获得含12个开放阅读框的完整基因簇序列，利用缺失、插入和移码突变分别破坏各crt基因，结合HPLC与吸收光谱分析突变株积累的中间产物，并对六个基因进行了功能指认：crtE编码33 kDa的GGPP合酶，crtB编码34 kDa的八氢番茄红素合酶（其C端20个氨基酸为活性必需），crtI编码54.5 kDa的八氢番茄红素脱氢酶（突变株呈白色并积累100%八氢番茄红素），crtY编码43 kDa的番茄红素环化酶（突变株积累53±3%八氢番茄红素和32±4%番茄红素），crtZ编码约20 kDa的β-胡萝卜素羟化酶（突变株积累71±1%β-胡萝卜素），crtX编码45 kDa的玉米黄质葡萄糖基转移酶。完整基因簇在E. coli中表达时，约95±4%产物为类胡萝卜素葡萄糖苷。该基因簇的组织方式与E. uredovora存在差异，如crtZ与crtB的3'端有60 bp反向重叠，表明两种物种间具有较大进化距离，同时证实该基因簇足以支撑从法尼基焦磷酸到玉米黄质二葡萄糖苷的完整合成。
创新点
首次完整解析了E. herbicola Eho10类胡萝卜素基因簇的12个开放阅读框，对其中6个crt基因进行了功能鉴定；发现crtZ与crtB的3'端有60 bp重叠且转录方向相反；发现该基因簇与E. uredovora的基因组织存在差异（如ORF6插入）。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtE | GGPP合酶（香叶基香叶基焦磷酸合酶） | 催化 | 催化FPP转化为GGPP；33 kDa；与E. uredovora一致性55%。 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtX | 玉米黄质葡萄糖基转移酶 | 催化 | 催化玉米黄质转化为玉米黄质单/二葡萄糖苷；45 kDa；与E. uredovora相似性45%。 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtY | 番茄红素环化酶 | 催化 | 催化番茄红素转化为β-胡萝卜素；43 kDa；与E. uredovora相似性58%。 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 催化八氢番茄红素经四步脱氢生成番茄红素；54.5 kDa；与E. uredovora一致性76%。 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 催化两分子GGPP缩合生成八氢番茄红素；34 kDa；与E. uredovora一致性64%。 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtZ | β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 催化β-胡萝卜素羟基化生成玉米黄质；约20 kDa；与E. uredovora一致性73%。 |
关键发现
- pPL376表达全套基因时，产物中约95±4%为类胡萝卜素葡萄糖苷
- crtE编码GGPP合酶（33 kDa），与E. uredovora对应蛋白有55%氨基酸一致性
- crtX编码玉米黄质葡萄糖基转移酶（45 kDa），与E. uredovora有45%相似性，其N端前18个氨基酸缺失不影响活性
- crtY编码番茄红素环化酶（43 kDa），与E. uredovora有58%相似性，pAPU211Y突变株积累53±3%八氢番茄红素和32±4%番茄红素
- crtI编码八氢番茄红素脱氢酶（54.5 kDa），与E. uredovora有76%一致性，pAPU211I突变株呈白色并积累100%八氢番茄红素
- crtB编码八氢番茄红素合酶（34 kDa），与E. uredovora有64%一致性，pAPU211B突变株积累GGPP，CrtB的C端20个氨基酸对其活性必需
- crtZ编码β-胡萝卜素羟化酶（约20 kDa），与E. uredovora有73%一致性，pAPU211Z突变株积累24±0.5%八氢番茄红素和71±1%β-胡萝卜素
- crtZ与crtB在3'端重叠60 bp且转录方向相反。
研究结论
E. herbicola Eho10的类胡萝卜素基因簇编码从FPP到玉米黄质二葡萄糖苷所需的全部酶，并能在E. coli中功能性表达。该基因簇的组织方式与E. uredovora存在差异，表明两种Erwinia物种间存在较大的进化距离。