Selection of Escherichia coli K12 1EA Mutants with Increased Synthesis of Ribitol Dehydrogenase
- 作者
- P. Kyslik, B. SikytA
- 单位
- Department of Technical Microbiology, Institute of Microbiology, Czechoslovak Academy of Sciences, 142 20 Prague 4
- DOI
- 10.1007/BF02875901
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
通过恒化器连续培养选择，提高大肠杆菌K12 1EA菌株中核糖醇脱氢酶（RDH）的合成水平，从而增强其利用非天然底物木糖醇的能力，并解析选择过程中相关基因表达的变化规律。
研究策略
以木糖醇为生长限制底物在恒化器中进行连续培养，施加选择压力；对UV诱变的亲本群体进行恒化器筛选，逐步降低木糖醇浓度（从13.1 mM降至4.1 mM）并提高选择压力；同时监测rbt和dal两个相邻分解代谢操纵子编码的RDH和ADH活性变化。
核心内容
该研究以木糖醇为唯一生长限制底物，对大肠杆菌K12杂交株1EA进行恒化器连续培养选择，并逐步降低木糖醇浓度以施加递增的选择压力，成功筛选出核糖醇脱氢酶（RDH）合成显著提高的突变株。经两轮选择，突变株11EA的RDH比活性达83 nkat/mg，约为亲本（20 nkat/mg）的4倍；进一步在4.1 mM木糖醇下获得的111EA，在酪蛋白水解物中RDH活性达209 nkat/mg，为亲本（17 nkat/mg）的12倍。选择过程中监测到rbt和dal两个相邻操纵子编码的RDH与ADH活性呈动态变化：初期两者分别增加5倍和20倍，随后ADH下降而RDH持续上升至150 nkat/mg。动力学分析显示，1EA、11EA和111EA的μmax分别为0.20、0.53和0.59 h⁻¹，Ks从7.30 mM降至1.20 mM，而三株菌的木糖醇/核糖醇底物活性比恒定在0.040—0.042，表明酶结构未改变。结果证实恒化器选择能有效富集RDH过量合成的突变株，基因扩增与去阻抑是其主要机制，但过量合成在无选择压力下不稳定。
创新点
首次在大肠杆菌K12杂交株1EA中通过恒化器选择获得RDH合成活性提高12倍的突变株111EA；揭示了选择过程中RDH和ADH活性的动态变化（初期两者均增加，随后RDH继续升高而ADH下降），表明基因扩增和调控的协同作用；比较了亲本和两株高产菌株的动力学参数（μmax和Ks）。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli K12 1EA | 核糖醇/木糖醇分解代谢途径（rbt操纵子） | rbt operon | 核糖醇脱氢酶（RDH, EC 1.1.1.56） | 催化 | 催化核糖醇氧化，也能氧化非天然底物木糖醇（高Km），是生长限制步骤 |
| Escherichia coli K12 1EA | D-阿拉伯醇分解代谢途径（dal操纵子） | dal operon | D-阿拉伯醇脱氢酶（ADH, EC 1.1.1.11） | 催化 | 催化D-阿拉伯醇氧化；恒化器选择初期活性增加20倍，后期下降 |
| Escherichia coli K12 11EA | 核糖醇/木糖醇分解代谢途径（rbt操纵子） | rbt operon | 核糖醇脱氢酶（RDH） | 催化 | 突变株11EA，RDH比活性83 nkat/mg，约为亲本（20 nkat/mg）的4倍 |
| Escherichia coli K12 111EA | 核糖醇/木糖醇分解代谢途径（rbt操纵子） | rbt operon | 核糖醇脱氢酶（RDH） | 催化 | 突变株111EA，在酪蛋白水解物中RDH比活性209 nkat/mg，为亲本（17 nkat/mg）的12倍，但无选择压力时不稳定 |
关键发现
- 从亲本1EA出发，经恒化器选择获得稳定突变株11EA，其RDH比活性为83 nkat/mg（约亲本20 nkat/mg的4倍）
- 进一步在4.1 mM木糖醇中选择获得突变株111EA，在酪蛋白水解物中RDH活性达209 nkat/mg，为亲本（17 nkat/mg）的12倍。恒化器选择初期（前5天）RDH和ADH活性分别增加5倍和20倍，随后ADH活性下降而RDH活性持续上升至150 nkat/mg。在木糖醇批式培养中，1EA、11EA和111EA的μmax分别为0.20、0.53和0.59 h⁻¹，Ks分别为7.30、6.00和1.20 mM。3株菌的X/R比（500 mM Xlt与50 mM Rbt底物活性比）均为0.040-0.042，表明酶结构未改变。111EA在无选择压力下RDH过量合成不稳定。
研究结论
通过在恒化器中以非天然底物木糖醇作为生长限制因子，能够有效筛选出RDH合成显著提高的大肠杆菌突变株；其中111EA的RDH活性比亲本高12倍，且Ks降低了5倍，显示了在连续培养中的竞争优势。选择过程中rbt和dal操纵子的表达动态表明，基因扩增和去阻抑是RDH过量合成的主要机制，但过量合成在缺乏选择压力时不稳定。