Lipid-Polyamide-Polyethyleneimine Microcapsules for Immobilization of Free Cofactors and Multienzyme System
- 作者
- E. Ilan, T. M. S. Chang
- 单位
- Artificial Cells and Organs Research Centre, Faculty of Medicine, McGill University, 3655 Drummond Street, Montreal, Canada
- DOI
- 10.1007/BF02798460
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何将游离辅因子NAD+和多酶系统牢固地截留在微胶囊内，实现氨到谷氨酸的连续转化，同时解决血红蛋白填充物会失活NAD+的问题
研究策略
采用脂质-聚酰胺微胶囊包埋L-谷氨酸脱氢酶、乙醇脱氢酶、游离NAD+和α-酮戊二酸，并用聚乙烯亚胺替代血红蛋白作为微胶囊填充物，利用乙醇脱氢酶在微胶囊内再生NAD+，实现辅因子循环和氨的转化
研究路线图
核心内容
该研究构建了以聚乙烯亚胺为填充物的脂质-聚酰胺微胶囊，用于共包埋L-谷氨酸脱氢酶、乙醇脱氢酶和游离辅因子NAD+，实现氨向谷氨酸的连续转化。与以往使用血红蛋白不同，聚乙烯亚胺避免了杂质对NAD+的失活作用，且无需繁琐纯化。微胶囊内乙醇脱氢酶通过氧化乙醇原位再生NAD+，使少量辅因子得以循环利用。实验表明，含0.50 μmol NAD+和两种酶的微胶囊在3小时内可将40 μmol氨转化为谷氨酸，NAD+循环次数达80次；对照实验证实无NAD+时仅发生平衡扩散，而含NADH但缺乏乙醇脱氢酶时转化效率显著降低，验证了辅因子再生系统的必要性。储存稳定性测试显示，微胶囊在1天、7天、16天和21天后分别保留100%、81%、56%和37%的活性。该策略有效解决了游离辅因子截留与再生问题，为多酶级联反应和辅因子依赖型生物转化提供了可行的人工细胞平台。
创新点
1. 用聚乙烯亚胺替代血红蛋白作为微胶囊填充物，避免了血红蛋白中杂质对NAD+的失活，且无需繁琐的纯化步骤；2. 实现了游离辅因子NAD+的截留和循环利用，使少量NAD+可反复使用；3. 提高了转化率和储存稳定性
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 脂质-聚酰胺微胶囊（人工细胞） | 氨转化为谷氨酸 | — | L-谷氨酸脱氢酶 (EC 1.4.1.3) | 催化 | 来自牛肝，比活36 U/mg，催化α-酮戊二酸与氨生成谷氨酸，同时氧化NADH |
| 脂质-聚酰胺微胶囊（人工细胞） | 辅因子再生（乙醇氧化） | — | 乙醇脱氢酶 (EC 1.1.1.1) | 催化 | 来自酵母，比活400 U/mg，催化乙醇氧化为乙醛，同时将NAD+还原为NADH，实现辅因子循环 |
关键发现
- 含0.50 μmol NAD+和两种酶的微胶囊在3 h内将40 μmol氨转化为谷氨酸，NAD+循环次数达80次
- 90 min时微胶囊内谷氨酸产量为31.5 μmol
- 无NAD+对照组氨浓度降至16.5 mM（仅平衡扩散）
- 含25 μmol NADH无乙醇脱氢酶时氨浓度降至11.5 mM
- 储存稳定性：1 d活性为40 μmol/3h，7 d保留81%（32.5 μmol），16 d保留56%（22.5 μmol），21 d保留37%（15 μmol）
研究结论
以聚乙烯亚胺为填充物的脂质-聚酰胺微胶囊可有效截留游离NAD+和多酶系统，高效转化氨为谷氨酸，并具备良好的储存稳定性，适用于生物技术和医学应用