Genetic analysis of pigment biosynthesis in Xanthobacter autotrophicus Py2 using a new, highly efficient transposon mutagenesis system that is functional in a wide variety of bacteria
- 作者
- Rachel A. Larsen, Marlena M. Wilson, Adam M. Guss, William W. Metcalf
- 杂志
- Archives of Microbiology（2002）
- DOI
- 10.1007/s00203-002-0442-2
- 所属领域
- 微生物遗传学
- 关键词
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解决的核心问题
开发一种高效、广宿主范围的转座子突变系统，用于 Xanthobacter autotrophicus Py2 的遗传分析，并阐明其黄色色素 zeaxanthin dirhamnoside 的生物合成基因。
研究策略
构建携带高活性 Tn5 转座酶基因的递送载体 pRL27，通过接合转移将其导入目标菌株，利用转座子随机插入进行突变，筛选色素缺陷突变体，并通过转座子携带的 R6K 复制起点一步克隆插入位点，进行序列分析和功能鉴定。
核心内容
本研究开发了一种基于高活性Tn5转座酶的新型广宿主转座子突变系统，并将其应用于自养黄色杆菌Py2的遗传分析。研究者构建了携带高活性转座酶基因的递送载体pRL27，通过接合转移导入目标菌株，利用转座子随机插入产生突变，并结合转座子携带的R6K复制起点实现插入位点的一步克隆。该系统在Xanthobacter autotrophicus Py2中实现了1.2±0.5×10⁻³/受体的转座频率，在Pseudomonas stutzeri和Alcaligenes faecalis中分别达到1.4×10⁻⁴和3.8×10⁻⁴，且对多种变形菌及蓝细菌均有功能。通过筛选约17,000个卡那霉素抗性突变体，共获得44个色素缺陷突变体，其中22个插入类胡萝卜素生物合成基因（crtE、crtB、crtI、crtY、ispA），3个插入hemA，2个插入fhuA。序列分析鉴定了crtYIB操纵子及其相邻的crtX基因；ispA突变体呈淡黄色提示存在替代途径，crtY突变体呈淡粉色则与极性效应一致。该研究首次在Xanthobacter中实现高效转座子突变，并揭示zeaxanthin dirhamnoside生物合成由与已知类胡萝卜素途径同源的基因催化，验证了该突变系统的随机性和有效性。
创新点
['利用高活性 Tn5 转座酶（比野生型高1000倍）提高转座效率', '采用 RP4 tetA 启动子驱动转座酶表达，使其在多种革兰氏阴性菌中具有功能性', '转座子携带 oriR6K 和 Km 抗性标记，便于一步克隆插入位点', '首次在 Xanthobacter 中实现高效转座子突变，并成功应用于 α、β、γ 变形菌及蓝细菌']
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Xanthobacter autotrophicus Py2 | zeaxanthin dirhamnoside 生物合成 | crtE | geranylgeranyl diphosphate synthase | 催化 | 突变导致白色菌落，阻断无色中间产物 |
| Xanthobacter autotrophicus Py2 | zeaxanthin dirhamnoside 生物合成 | crtB | phytoene synthase | 催化 | 突变导致白色菌落 |
| Xanthobacter autotrophicus Py2 | zeaxanthin dirhamnoside 生物合成 | crtI | phytoene dehydrogenase | 催化 | 突变导致白色菌落 |
| Xanthobacter autotrophicus Py2 | zeaxanthin dirhamnoside 生物合成 | crtY | lycopene cyclase | 催化 | 位于 crtYIB 操纵子第一个基因，突变通常导致淡粉色菌落（累积 lycopene），除极性方向相反突变体 |
| Xanthobacter autotrophicus Py2 | zeaxanthin dirhamnoside 生物合成 | crtX | UDP-glucosyltransferase (推测为 rhamnosyl transferase) | 催化 | 位于 crtYIB 下游，与 zeaxanthin 的糖基化有关 |
| Xanthobacter autotrophicus Py2 | zeaxanthin dirhamnoside 生物合成 | ispA | farnesyl pyrophosphate synthase | 催化 | 突变产生淡黄色表型，表明存在替代 FPP 合成途径 |
| Xanthobacter autotrophicus Py2 | heme 生物合成 | hemA | aminolevulinate synthase | 催化 | 突变体呈黄棕色，可能影响细胞色素 |
| Xanthobacter autotrophicus Py2 | 铁载体转运 | fhuA | siderophore receptor | 转运 | 突变体呈淡黄色，可能因铁载体积累 |
| Pseudomonas stutzeri | 半胱氨酸生物合成 | cysD | sulfate adenylyltransferase (推测) | 催化 | 突变体为半胱氨酸营养缺陷型 |
| Pseudomonas stutzeri | 半胱氨酸生物合成 | cysN/cysC | sulfate adenylyltransferase 相关蛋白 | 催化 | 突变体为半胱氨酸营养缺陷型 |
| Pseudomonas stutzeri | NAD 生物合成 | nadB | L-aspartate oxidase (quinoline synthase) | 催化 | 突变体需烟酸补充 |
| Alcaligenes faecalis | 磷同化 | — | alkaline phosphatase | 催化 | 影响磷酸源利用 |
| Alcaligenes faecalis | 次磷酸盐转运 | — | hypophosphite transporter | 转运 | 影响次磷酸盐利用 |
关键发现
- 在 Xanthobacter autotrophicus Py2 中，转座频率达
- 2±0.5×10^-3/受体；P. stutzeri 中为
- 4±0.2×10^-4，A. faecalis 中为
- 8±0.5×10^-4。从约17,000个Km抗性突变体中筛出44个色素突变体，色素突变频率约10^-3。其中22个插入类胡萝卜素生物合成基因（crtE、crtB、crtI、crtY、ispA），3个插入hemA，2个插入fhuA，2个插入未知基因。所有插入均产生9-bp靶位点重复。鉴定出 crtYIB 操纵子及其相邻的 crtX 基因；ispA 突变体呈淡黄色，表明存在替代途径；crtY 突变体呈淡粉色，与极性效应和 Km 基因方向一致。
研究结论
成功开发了基于高活性 Tn5 的广宿主转座子突变系统，可在多种变形菌中高效工作。通过筛选色素突变体，揭示了 X. autotrophicus Py2 的 zeaxanthin dirhamnoside 生物合成由与已知类胡萝卜素途径同源的基因（crtYIB、crtE、ispA 等）催化完成，验证了该突变系统的随机性和有效性。