Environmental and physiological factors affecting the succinate product ratio during carbohydrate fermentation by Actinobacillus sp. 130Z

作者: Mariët J. Van der Werf, Michael V. Guettler, Mahendra K. Jain, J. Gregory Zeikus
单位: Department of Biochemistry, Michigan State University, East Lansing, MI 48824, USA; MBI International, 3900 Collins Road, P.O. Box 27609, Lansing, MI 48909-0609, USA; Department of Animal Science, Michigan State University, East Lansing, MI 48824, USA
杂志: Archives of Microbiology（1997）
DOI: 10.1007/s002030050452
所属领域: 代谢工程
关键词: Actinobacillus sp. 130ZCarbon dioxide fixationEscherichia coliFermentationFumarate reductionMetabolic fluxesPhosphoenolpyruvateSuccinate
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解决的核心问题

研究环境因素（CO2、氢气、底物氧化还原态）和生理因素（酶活性）对Actinobacillus sp. 130Z发酵碳水化合物时琥珀酸产物比例的影响，揭示该菌高产琥珀酸的生化机制。

研究策略

通过改变CO2浓度、气体组成（氢气）和不同氧化还原态的碳水化合物，分析发酵产物平衡；比较Actinobacillus sp. 130Z与Escherichia coli K-12的关键酶活性水平；检测不同生长底物下相关酶活性的调节。

研究路线图

100%

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核心内容

研究通过调控CO2浓度、氢气供给及底物氧化还原态，并结合关键酶活性比较，解析了Actinobacillus sp. 130Z高产琥珀酸的生化机制。结果显示，CO2从100%降至10%时，琥珀酸产量由69 mol降至19 mol/100 mol葡萄糖，乙醇则从18 mol升至71 mol；氢气从无到100%时，琥珀酸产量从80增至112 mol/100 mol葡萄糖，琥珀酸与（乙酸+乙醇）的产物比由1.07升至1.45。以更还原的D-阿拉伯醇为底物时，琥珀酸达103 mol/100 mol底物。与大肠杆菌K-12相比，该菌PEP羧激酶、苹果酸脱氢酶和延胡索酸酶活性分别高34倍、13倍和19倍（4700对140、2100对160、8600对450 nmol min⁻¹ mg⁻¹），且PEP羧激酶为组成型表达。pH在6.0至7.4间不影响产物比例。这些结果说明，CO2和电子供体是决定琥珀酸产量的关键环境因子，而琥珀酸合成途径酶的高水平组成型表达是该菌高产的内在基础，其利用氢气作为电子供体的能力也提示了实现同型琥珀酸发酵的代谢工程潜力。

创新点

1. 发现CO2限制条件下琥珀酸减少而乙醇增加，氢气促进琥珀酸产生，并能以氢为电子供体还原延胡索酸生长；2. 证明Actinobacillus sp. 130Z中PEP羧激酶等琥珀酸合成关键酶活性显著高于E.coli，且PEP羧激酶为组成型表达；3. 提出该菌可能实现同型琥珀酸发酵。

研究对象（17）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Actinobacillus sp. 130Z	琥珀酸生物合成	—	PEP carboxykinase	催化	催化PEP固定CO2生成草酰乙酸，活性4700 nmol min-1 mg-1，为E.coli的34倍。
Actinobacillus sp. 130Z	琥珀酸生物合成	—	Malate dehydrogenase	催化	催化草酰乙酸还原为苹果酸，活性2100 nmol min-1 mg-1，为E.coli的13倍。
Actinobacillus sp. 130Z	琥珀酸生物合成	—	Fumarase	催化	催化苹果酸脱水为延胡索酸，活性8600 nmol min-1 mg-1，为E.coli的19倍。
Actinobacillus sp. 130Z	琥珀酸生物合成	—	Fumarate reductase	催化	催化延胡索酸还原为琥珀酸，活性1200 nmol min-1 mg-1，与E.coli相当。
Actinobacillus sp. 130Z	丙酮酸代谢	—	Pyruvate kinase	催化	催化PEP转化为丙酮酸，活性1100 nmol min-1 mg-1，与E.coli相当。
Actinobacillus sp. 130Z	丙酮酸代谢	—	Pyruvate formate-lyase	催化	催化丙酮酸裂解为乙酰CoA和甲酸，活性390 nmol min-1 mg-1，低于E.coli的1400。
Actinobacillus sp. 130Z	氢代谢	—	Hydrogenase	催化	催化H2氧化提供还原力，活性11 nmol min-1 mg-1，在延胡索酸+H2生长时上调至130。
Actinobacillus sp. 130Z	乙醇合成	—	Alcohol dehydrogenase	催化	催化乙醛还原为乙醇，活性17 nmol min-1 mg-1，D-山梨醇生长时升至2700。
Actinobacillus sp. 130Z	乙醇合成	—	Acetaldehyde dehydrogenase	催化	催化乙酰CoA还原为乙醛，活性11 nmol min-1 mg-1，D-山梨醇生长时升至430。
Actinobacillus sp. 130Z	糖转运	—	Glucose:PEP phosphotransferase	转运	PTS系统组分，催化葡萄糖磷酸化并转运，活性21 nmol min-1 mg-1。
Actinobacillus sp. 130Z	乙酸合成	—	Phosphotransacetylase	催化	催化乙酰CoA转化为乙酰磷酸，活性240 nmol min-1 mg-1。
Actinobacillus sp. 130Z	乙酸合成	—	Acetate kinase	催化	催化乙酰磷酸转化为乙酸并生成ATP，活性3200 nmol min-1 mg-1。
Actinobacillus sp. 130Z	苹果酸代谢	—	Malic enzyme	催化	催化苹果酸氧化脱羧为丙酮酸，活性360 nmol min-1 mg-1，E.coli中缺失。
Actinobacillus sp. 130Z	草酰乙酸代谢	—	Oxaloacetate decarboxylase	催化	催化草酰乙酸脱羧为丙酮酸，活性75 nmol min-1 mg-1，E.coli中缺失。
Actinobacillus sp. 130Z	C4二羧酸途径	—	PEP carboxylase	催化	催化PEP羧化生成草酰乙酸，活性10 nmol min-1 mg-1，远低于PEP羧激酶。
Actinobacillus sp. 130Z	糖酵解	—	Enolase	催化	催化2-磷酸甘油酸脱水生成PEP，活性8300 nmol min-1 mg-1。
Actinobacillus sp. 130Z	乳酸代谢	—	Lactate dehydrogenase	催化	催化丙酮酸还原为乳酸，活性9 nmol min-1 mg-1，但发酵中未检测到乳酸。

关键发现

CO2浓度从100降低到10时，琥珀酸产量从69 mol/100 mol葡萄糖降至19 mol，乙醇从18升至71 mol
氢气从无到100%时，琥珀酸从80增至112 mol/100 mol葡萄糖，琥珀酸产物比（琥珀酸/(乙酸+乙醇)）从1.07升至1.45
利用更还原底物D-阿拉伯醇时琥珀酸达103 mol/100 mol底物
与E.coli K-12相比，Actinobacillus sp. 130Z的PEP羧激酶、苹果酸脱氢酶和延胡索酸酶活性分别高34倍、13倍和19倍（4700 vs 140, 2100 vs 160, 8600 vs 450 nmol min-1 mg-1）。pH在6.0-7.4间不影响产物比例。

研究结论

Actinobacillus sp. 130Z的琥珀酸产量受CO2和电子供体（氢气）影响，其高产琥珀酸主要归因于琥珀酸合成途径中PEP羧激酶、苹果酸脱氢酶和延胡索酸酶的高表达，且PEP羧激酶为组成型。该菌可利用氢气作为电子供体，有望通过代谢工程实现同型琥珀酸发酵。