Carbon partitioning to the terpenoid biosynthetic pathway enables heterologous β-hellandrene production in Escherichia coli cultures
- 作者
- Cinzia Formighieri, Anastasios Melis
- 单位
- Department of Plant and Microbial Biology, University of California, 111 Koshland Hall, Berkeley, CA 94720-3102, USA
- 杂志
- Archives of Microbiology（2014）
- DOI
- 10.1007/s00203-014-1024-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
大肠杆菌异源合成β-水芹烯时，内源MEP途径碳通量不足，导致前体IPP和DMAPP供应有限，即使异源表达合酶也无法积累产物。
研究策略
在大肠杆菌中异源共表达薰衣草β-水芹烯合酶（PHLS）、挪威云杉牻牛儿基二磷酸合酶（GPPS2）以及完整的甲羟戊酸（MVA）途径，比较不同基因组合对β-水芹烯积累的影响。
核心内容
该研究针对大肠杆菌异源合成β-水芹烯时内源MEP途径碳通量不足、前体供应受限的问题，在E. coli Rosetta中系统比较了不同基因组合对产物积累的影响。作者分别单独表达薰衣草β-水芹烯合酶（PHLS）、共表达PHLS与挪威云杉牻牛儿基二磷酸合酶（GPPS2），以及在此基础上异源引入完整的甲羟戊酸（MVA）途径。结果显示，单独表达PHLS或PHLS+GPPS均无法检测到β-水芹烯；在M9甘油培养基中，PHLS+MVA产量为1.1 mg/g DCW，而PHLS+GPPS+MVA提升至3 mg/g DCW。在LB+1%葡萄糖培养基中，20 h时PHLS+GPPS+MVA产量达11 mg/g DCW，72 h时进一步增至25 mg/g DCW，产物中β-水芹烯占87%，副产物为β-月桂烯（11%）和β-蒎烯（2%）。该结果表明，异源MVA途径的引入有效解除了内源MEP途径碳通量的限制，是启动单萜生物合成的关键策略，也揭示了非光合细菌与光合蓝细菌在异戊二烯前体碳分配上的本质差异。
创新点
揭示了非光合细菌与光合蓝细菌在异戊二烯前体碳分配上的差异；证明在E. coli中异源表达MVA途径是启动单萜生物合成的有效策略。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli Rosetta | 单萜生物合成 | PHLS | β-水芹烯合酶（PHLS） | 催化 | 来自薰衣草（Lavandula angustifolia），以GPP为底物催化生成β-水芹烯 |
| Escherichia coli Rosetta | 单萜生物合成 | GPPS2 | 牻牛儿基二磷酸合酶（GPPS2） | 催化 | 来自挪威云杉（Picea abies），催化IPP与DMAPP缩合生成GPP |
| Escherichia coli Rosetta | 甲羟戊酸（MVA）途径 | HMGS | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶（HMGS） | 催化 | 来自粪肠球菌（Enterococcus faecalis） |
| Escherichia coli Rosetta | 甲羟戊酸（MVA）途径 | HMGR | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR） | 催化 | 来自粪肠球菌（Enterococcus faecalis） |
| Escherichia coli Rosetta | 甲羟戊酸（MVA）途径 | ATOB | 乙酰辅酶A乙酰转移酶（ATOB） | 催化 | 来自大肠杆菌（Escherichia coli） |
| Escherichia coli Rosetta | 甲羟戊酸（MVA）途径 | FNI | 异戊烯基焦磷酸异构酶（FNI） | 催化 | 来自肺炎链球菌R6（Streptococcus pneumoniae R6） |
| Escherichia coli Rosetta | 甲羟戊酸（MVA）途径 | MK | 甲羟戊酸激酶（MK） | 催化 | 来自肺炎链球菌R6（Streptococcus pneumoniae R6） |
| Escherichia coli Rosetta | 甲羟戊酸（MVA）途径 | PMK | 磷酸甲羟戊酸激酶（PMK） | 催化 | 来自肺炎链球菌R6（Streptococcus pneumoniae R6） |
| Escherichia coli Rosetta | 甲羟戊酸（MVA）途径 | PMD | 二磷酸甲羟戊酸脱羧酶（PMD） | 催化 | 来自肺炎链球菌R6（Streptococcus pneumoniae R6） |
关键发现
- 单独表达PHLS或PHLS+GPPS均无法检测到β-水芹烯
- 在M9甘油培养基中，PHLS+MVA产量为1.1 mg/g DCW，PHLS+GPPS+MVA为3 mg/g DCW
- 在LB+1%葡萄糖培养基中，20 h时PHLS+MVA产量为5.7 mg/g DCW，PHLS+GPPS+MVA为11 mg/g DCW，72 h时达25 mg/g DCW
- 产物的主要成分为β-水芹烯（87%），副产物为β-月桂烯（11%）和β-蒎烯（2%）。
研究结论
在E. coli中异源表达PHLS基因是β-水芹烯合成所必需的，但仅有PHLS不足以实现生产；必须异源表达MVA途径以增强IPP/DMAPP供应，从而解除内源MEP途径碳通量的限制。E. coli与Synechocystis的差异源于后者为光合作用需要合成大量类异戊二烯，因此MEP途径碳通量远高于前者。