Cloning and Characterization of Saponin Hydrolases from Aspergillus oryzae and Eupenicillium brefeldianum

作者: Manabu WATANABE, Naomi SUMIDA, Koji YANAI, Takeshi MURAKAMI
单位: Microbiological Resources and Technology Laboratories, Meiji Seika Kaisha, Ltd., Kayama 788, Odawara-shi, Kanagawa 250-0852, Japan
杂志: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry（2005）
DOI: 10.1271/bbb.69.2178
所属领域: 酶工程
关键词: Aspergillus oryzaeEupenicillium brefeldianumsoyasapogenol Bsoyasaponins
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解决的核心问题

克隆并表征来自腐生真菌米曲霉和Eupenicillium brefeldianum的皂苷水解酶基因，探讨其与植物病原真菌来源皂苷水解酶的进化关系。

研究策略

通过活性筛选从两株腐生真菌纯化皂苷水解酶，基于肽段序列设计引物克隆基因，在里氏木霉中进行异源表达，比较重组酶与已知酶Sdn1的酶学性质。

研究路线图

100%

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核心内容

本研究从两株腐生真菌米曲霉PF1224和Eupenicillium brefeldianum PF1226中通过活性筛选纯化了皂苷水解酶Sda1和Sde1，并利用肽段序列信息设计引物克隆了编码基因sda1（1902 bp）和sde1（1857 bp）。序列分析显示两者分别编码605和601个氨基酸，与已知植物病原真菌来源的Sdn1具有约50%的氨基酸序列相似性。将两基因在里氏木霉中异源表达后，重组蛋白经去糖基化处理后分子量分别降至71 kDa和66 kDa，表明天然酶存在糖基化修饰。以大豆皂苷I为底物，重组Sda1和Sde1的比活分别为1.1和3.4 units/min/μg，远低于Sdn1的16.3 units/min/μg，且最高培养上清活性分别可达1658和3745 units/ml。两酶最适pH分别为5.2和5.4，最适温度分别为50°C和45°C。研究首次证明皂苷水解酶并非植物病原真菌所特有，而是广泛存在于需要降解皂苷的丝状真菌中，不同来源酶在比活和底物偏好上的差异可能反映了各自生态位的适应性演化。

创新点

首次报道了腐生真菌来源的皂苷水解酶基因sda1和sde1，证明它们与病原真菌来源的sdn1同源，表明该类酶并非病原菌特异，而是在丝状真菌中广泛存在。

研究对象（4）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Aspergillus oryzae PF1224	大豆皂苷水解	sda1	Sda1	催化	天然来源菌株，分泌皂苷水解酶，分子量82 kDa
Eupenicillium brefeldianum PF1226	大豆皂苷水解	sde1	Sde1	催化	天然来源菌株，分泌皂苷水解酶，分子量90 kDa
Trichoderma viride strain 2	异源表达	sda1, sde1	重组Sda1和Sde1	催化	表达宿主，利用cbh1启动子分泌重组蛋白
Neocosmopora vasinfecta var. vasinfecta PF1225	大豆皂苷水解	sdn1	Sdn1	催化	已知皂苷水解酶，用于比较

关键发现

从A. oryzae PF1224和E. brefeldianum PF1226分别纯化到分子量约82 kDa和90 kDa的皂苷水解酶Sda1和Sde1
克隆的sda1（1902 bp）和sde1（1857 bp）分别编码605和601个氨基酸（计算分子量65,252 Da和64,874 Da）
在T. viride中异源表达后重组蛋白分子量为77 kDa和67 kDa，去糖基化后为71 kDa和66 kDa
重组酶水解大豆皂苷I生成大豆皂醇B和三糖
以大豆皂苷I为底物，Sdn1、Sda1、Sde1的比活分别为16.3、1.1、3.4 units/min/μg
最高培养上清活性分别为1658和3745 units/ml
Sda1和Sde1的最适pH分别为5.2和5.4，最适温度分别为50°C和45°C
与Sdn1氨基酸序列相似性约50%。

研究结论

腐生真菌和植物病原真菌拥有同源的皂苷水解酶，该类酶广泛存在于需要降解皂苷的丝状真菌中；Sda1和Sde1的比活及底物偏好性与Sdn1存在差异，可能反映了各自环境的适应。