Identification of Diterpene Biosynthetic Gene Clusters and Functional Analysis of Labdane-Related Diterpene Cyclases in Phomopsis amygdali
- 作者
- Tomonobu Toyomasu, Rie Niida, Hiromichi Kenmoku, Yuri Kanno, Shigeyoshi Miura, Chiaki Nakano, Yoshihito Shiono, Wataru Mitsuhashi, Hiroaki Toshima, Hideaki Oikawa, Tsutomu Hoshino, Tohru Dairi, Nobuo Kato, Takeshi Sassa
- 单位
- 山形大学生物资源工程系；新潟大学科学与技术研究生院；茨城大学农学系生物资源科学系；北海道大学科学研究生院化学部；富山県立大学生物技术研究中心；大阪大学产业科学研究所
- 杂志
- Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry（2008）
- DOI
- 10.1271/bbb.70790
- 所属领域
- 天然产物生物合成
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定产 fusicoccin 的真菌 Phomopsis amygdali 中二萜生物合成基因簇，并解析 labdane 相关二萜环化酶的功能，从而发现新二萜化合物。
研究策略
以 GGDP 合酶基因 PaGGS1 和 PaGGS4 为起点进行基因组步移，获得其邻近的二萜环化酶基因 PaDC1 和 PaDC2；通过异源表达和体外酶活分析确定产物结构；进一步从 P. amygdali 菌丝体中分离相应的天然产物。
核心内容
本研究以产fusicoccin的真菌Phomopsis amygdali为对象，通过基因组步移策略从两个GGDP合酶基因PaGGS1和PaGGS4出发，分别获取了约26 kb和14 kb的基因组DNA序列，并鉴定了两个二萜环化酶基因PaDC1和PaDC2。异源表达与体外酶活分析表明，PaDC1编码1005个氨基酸的双功能酶，以GGDP为底物经(+)-copalyl diphosphate（CDP）中间体主要生成phyllocladan-16α-ol，副产物包括多种pimarane型二萜烯烃；PaDC2编码984个氨基酸，直接将GGDP转化为(+)-CDP，其去磷酸化产物copalol的比旋光度为+30.6°。这是首次在真菌中报道以(+)-CDP为中间体的labdane相关双功能环化酶，以及天然来源的(+)-CDP合酶。从P. amygdali菌丝体及培养液中分离得到phyllocladan-16α-ol（0.2 mg/95 g菌丝体）和新二萜phyllocladan-11α,16α,18-triol（14.4 mg/4.5 L培养液，熔点295–300°C）。该工作揭示了真菌中新的二萜环化酶催化机制，并证明基因组步移策略是发现真菌新天然产物的有效途径。
创新点
['首次在真菌中鉴定了通过 (+)-copalyl diphosphate (CDP) 中间体的双功能 labdane 相关二萜环化酶（PaDC1）', '首次鉴定了天然来源的 (+)-CDP 合酶（PaDC2），其直接以 (+)-CDP 为终产物', '从 P. amygdali 中发现新二萜化合物 phyllocladan-11α,16α,18-triol', '提出基因组步移策略是发现真菌新天然产物的有效方法']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Phomopsis amygdali N2 | 二萜生物合成 | PaGGS1 | PaGGS1 (GGDP合酶) | 催化 | 基因组步移起点，编码 geranylgeranyl diphosphate (GGDP) 合酶，催化 GDP 或 FDP 与 IPP 生成 GGDP。 |
| Phomopsis amygdali N2 | 二萜生物合成 | PaGGS4 | PaGGS4 (GGDP合酶) | 催化 | 基因组步移起点，编码 GGDP 合酶，催化 DMAPP、GDP 或 FDP 与 IPP 生成 GGDP。 |
| E. coli XL1-Blue | 二萜生物合成 | PaDC1 | PaDC1 (phyllocladan-16α-ol合酶) | 催化 | 重组 GST-PaDC1 催化 GGDP 经 (+)-CDP 生成 phyllocladan-16α-ol，并产生痕量 labdane 相关烃类。 |
| E. coli BL21(DE3) | 二萜生物合成 | PaDC2 | PaDC2 ((+)-CDP合酶) | 催化 | 重组 GST-PaDC2 催化 GGDP 生成 (+)-CDP，终产物为 (+)-CDP，未检测到进一步环化产物。 |
关键发现
通过基因组步移从 PaGGS1 和 PaGGS4 分别获得约 26 kb 和 14 kb 的基因组 DNA 序列（登录号 AB254158 和 AB254160）。PaDC1 和 PaDC2 分别编码 1005 个氨基酸 (113 kDa) 和 984 个氨基酸 (110 kDa) 的蛋白。重组 PaDC1 以 GGDP 为底物主要生成 phyllocladan-16α-ol（经 (+)-CDP），副产物包括 (+)-isopimara-8,15-diene、pimara-8,15-diene、(+)-pimara-8(14),15-diene、(-)-sandaracopimaradiene、(+)-phyllocladene 和 (+)-kaurene。重组 PaDC2 将 GGDP 转化为 (+)-CDP，其去磷酸化产物 copalol 的比旋光度 [α]D24=+30.6°。从 P. amygdali F6 菌丝体中分离得到 phyllocladan-16α-ol（0.2 mg，来自 95 g 菌丝体）和新的 phyllocladan-11α,16α,18-triol（14.4 mg，来自 4.5 L 培养液，熔点 295-300°C，[α]D20=+3.5°）。此外，重组 PaGGS1 催化 GDP 或 FDP 与 IPP 生成 GGDP，PaGGS4 催化 DMAPP、GDP 或 FDP 与 IPP 生成 GGDP。
研究结论
本研究通过基因组步移策略鉴定了 P. amygdali 中两个二萜生物合成基因簇，解析了 PaDC1 和 PaDC2 的催化功能，分别鉴定为 phyllocladan-16α-ol 合酶和 (+)-CDP 合酶，并发现新二萜 phyllocladan-11α,16α,18-triol。这一策略有助于真菌新天然产物的发现和开发。