Lactic acid production by Rhizopus oryzae transforms with modified lactate dehydrogenase activity
- 作者
- C. D. Skory
- 单位
- Fermentation Biotechnology Research Unit, National Center for Agricultural Utilization Research, USDA, Agricultural Research Service, 1815 N. University Street, Peoria, IL 61604, USA
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2003）
- DOI
- 10.1007/s00253-003-1480-7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
提高Rhizopus oryzae乳酸产量，通过增强乳酸脱氢酶（LDH）活性使乳酸发酵更有效地竞争丙酮酸，减少乙醇和富马酸等副产物。
研究策略
构建三种含不同长度ldhA基因片段的质粒（pLdhA71X、pLdhA48XI、pLdhA89VII），转化R. oryzae，通过多拷贝游离复制或整合到pyrG基因位点，比较不同转化子的ldhA拷贝数、转录水平、LDH酶活及发酵产物积累，评估对乳酸生产的影响。
核心内容
研究构建了三种携带不同长度ldhA基因片段的质粒转化米根霉NRRL 395，以调节乳酸脱氢酶活性来优化乳酸发酵。pLdhA71X转化子在47小时和70.5小时乳酸产量分别达76.0 g/l和77.5 g/l，较对照提高约7%，同时乙醇和富马酸分别降低约20%和150%。而携带最长片段的pLdhA89VII虽使LDH比活达到对照的约5倍，ldhA转录水平提高10倍以上，但乳酸产量反而仅为对照的42%，伴随乙醇增加130%、富马酸增加900%，表明过度增强LDH活性会破坏辅因子平衡或引起胞内酸积累，不利于乳酸合成。pLdhA48XI整合型转化子表现出中等产量且具有染色体整合带来的稳定性优势。研究揭示LDH活性存在最佳窗口，适度增强可有效分流丙酮酸至乳酸并抑制副产物生成，为丝状真菌乳酸发酵的代谢工程改造提供了重要参考。
创新点
比较不同长度ldhA侧翼区对乳酸生产的影响；利用线性化质粒促进染色体整合提高稳定性；发现过高LDH活性反而导致乳酸产量下降并伴随副产物增加。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rhizopus oryzae NRRL 395 | 乳酸发酵/丙酮酸代谢 | ldhA | 乳酸脱氢酶 (LdhA) | 催化 | 将丙酮酸转化为乳酸，是本研究过表达的目标基因 |
| Rhizopus oryzae NRRL 395 | 乙醇发酵 | pdcA | 丙酮酸脱羧酶 (PDC) | 催化 | 将丙酮酸转化为乙醛，与LDH竞争丙酮酸 |
| Rhizopus oryzae NRRL 395 | 乙醇发酵 | pdcB | 丙酮酸脱羧酶 (PDC) | 催化 | 与pdcA共同作用，将丙酮酸转化为乙醛 |
| Rhizopus oryzae NRRL 395 | 富马酸合成 | pyrG | 乳清苷酸脱羧酶 | 调控 | 作为转化筛选标记基因，线性化质粒整合到该位点 |
| Rhizopus oryzae NRRL 395 | 丙酮酸代谢/富马酸合成 | pyruvate carboxylase | 丙酮酸羧化酶 | 催化 | 催化丙酮酸转化为草酰乙酸，进入富马酸合成途径 |
| Rhizopus oryzae NRRL 395 | 丙酮酸代谢/富马酸合成 | malate dehydrogenase | 苹果酸脱氢酶 | 催化 | 催化草酰乙酸转化为苹果酸 |
关键发现
- pLdhA71X转化子在47h和70.5h时乳酸产量比对照增加约7%（76.0 g/l vs
- 9 g/l
- 5 g/l vs
- 6 g/l），乙醇降低约20%（9.0 g/l vs
- 2 g/l
- 7 g/l vs
- 2 g/l），富马酸降低约150%（0.059 g/l vs
- 199 g/l
- 055 g/l vs
- 206 g/l）。pLdhA89VII转化子LDH比活最高（24h达5.67 units/mg protein），是对照的约5倍，但乳酸产量仅为对照的约42%（27.2 g/l vs
- 9 g/l），乙醇增加130%（18.4 g/l vs
- 2 g/l），富马酸增加900%（1.652 g/l vs
- 199 g/l），甘油增加50%（2.69 g/l vs
- 21 g/l）。pLdhA89VII的ldhA转录水平比对照高10倍以上。pLdhA48XI整合型转化子（A和B）乳酸产量分别达74.9和72.8 g/l（47h），也高于对照。
研究结论
增加LDH活性通常能提高乳酸产量并减少乙醇和富马酸，但过高LDH活性（如pLdhA89VII）可能破坏辅因子平衡或导致细胞内酸积累，反而降低乳酸生产。含有较大ldhA片段（6.1kb）的pLdhA71X质粒最为有效，染色体整合虽增加稳定性但未带来额外产量优势。