CYP175A1 from Thermus thermophilus HB27, the first β-carotene hydroxylase of the P450 superfamily
- 作者
- F. Blasco, I. Kauffmann, R. D. Schmid
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2004）
- DOI
- 10.1007/s00253-003-1529-7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定嗜热菌Thermus thermophilus HB27中P450单加氧酶CYP175A1的生物学功能，并验证其是否参与类胡萝卜素生物合成。
研究策略
利用大肠杆菌异源功能互补策略，在产β-胡萝卜素的大肠杆菌菌株中共表达CYP175A1基因及类胡萝卜素合成基因，通过色谱和波谱方法分析产物，从而确定CYP175A1的催化活性。
核心内容
该研究从嗜热菌Thermus thermophilus HB27中克隆了P450超家族单加氧酶基因CYP175A1，并通过大肠杆菌异源共表达策略验证其功能。在产β-胡萝卜素的大肠杆菌菌株中共表达CYP175A1及类胡萝卜素合成基因，色谱和波谱分析表明该酶催化β-胡萝卜素两个β环的羟基化，生成β-隐黄质和玉米黄质；与雨生红球藻的酮化酶bkt共表达时，还能合成3′-羟基海胆酮，而空载体对照仅积累β-胡萝卜素。序列分析显示CYP175A1与巨大芽孢杆菌P450 BM3的一致性为41%，但与已知crtZ类β-胡萝卜素羟化酶无序列相似性。这是P450超家族中首个被确证具有β-胡萝卜素羟化酶活性的成员，其催化机制和进化来源均区别于已知非P450型羟化酶，为类胡萝卜素生物合成提供了新的酶学工具和进化视角。
创新点
首次发现P450超家族成员具有β-胡萝卜素羟化酶活性，且其氨基酸序列与已知的β-胡萝卜素羟化酶没有显著相似性，代表一种新型的β-胡萝卜素羟化酶。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素生物合成通路 | CYP175A1 | CYP175A1 P450单加氧酶 | 催化 | 来自Thermus thermophilus HB27的嗜热P450，催化β-胡萝卜素羟化生成β-隐黄质和玉米黄质 |
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素生物合成通路 | crtE, crtB, crtI, crtY | CrtE, CrtB, CrtI, CrtY | 催化 | 来自Erwinia uredovora的类胡萝卜素合成基因，使大肠杆菌积累β-胡萝卜素 |
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素生物合成通路 | bkt | β-胡萝卜素酮化酶 | 催化 | 来自Haematococcus pluvialis，将β-胡萝卜素转化为海胆酮和角黄素 |
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素生物合成通路 | crtB | 八氢番茄红素合成酶 | 催化 | 来自Thermus thermophilus，位于CYP175A1基因附近，提示类胡萝卜素基因簇存在 |
关键发现
- 在大肠杆菌中，CYP175A1催化β-胡萝卜素两个β环的羟基化，生成β-隐黄质和玉米黄质（zeaxanthin）
- 当与Haematococcus pluvialis的β-胡萝卜素酮化酶bkt共表达时，可合成3′-羟基海胆酮。CYP175A1与Bacillus megaterium的CYP102A1（P450 BM3）氨基酸序列一致性为41%，但与已知crtZ类β-胡萝卜素羟化酶无序列相似性。对照菌株（空载体）仅积累β-胡萝卜素。
研究结论
CYP175A1是P450超家族中第一个被确证具有β-胡萝卜素羟化酶功能的酶，其催化机制不同于已知的非P450型β-胡萝卜素羟化酶，可能代表新的进化分支。