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Characterization of two β-carotene ketolases, CrtO and CrtW, by complementation analysis in Escherichia coli

作者
Seon- Kang Choi, Hisashi Harada, Satoru Matsuda, Norihiko Misawa
单位
Marine Biotechnology Institute, Heita, Kamaishi-shi, Iwate 026-0001, Japan; Gangneung Marine Bio Foundation, Gangneung, Gangwon 210-340, South Korea
杂志
Applied Microbiology and Biotechnology（2007）
DOI
10.1007/s00253-007-0967-z
所属领域
代谢工程
关键词
AstaxanthinCarotenoidCrtOCrtW
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解决的核心问题

比较两种结构不同的β-胡萝卜素酮酶（CrtO和CrtW）的催化功能，确定哪种酶能够以玉米黄质为底物合成虾青素，为异源生产虾青素筛选最佳酶基因。

研究策略

利用大肠杆菌互补分析系统，分别在积累β-胡萝卜素或玉米黄质的大肠杆菌中表达来自不同菌株的crtO和crtW基因，通过HPLC-PDA和HPLC-PDA-APCI-MS分析产物积累，比较各酶的催化效率和底物特异性。

研究路线图

100%
研究问题：比较CrtO与CrtW两种β-胡萝卜素酮酶的催化功能差异，筛选合成虾青素的最佳酶基因
策略：构建大肠杆菌互补分析系统，在积累β-胡萝卜素或玉米黄质菌株中分别表达crtO和crtW基因
关键改造1：在大肠杆菌中构建β-胡萝卜素合成模块（crtE/B/I/Y）和玉米黄质合成模块（加crtZ）
关键改造2：在两种底物积累菌株中分别导入crtO（来自Rhodococcus和Synechocystis）或crtW（来自Brevundimonas）
结果1：CrtW（SD212）24h高效将β-胡萝卜素转化为角黄素；CrtO（Rhodococcus）48h产物为角黄素但残留中间产物；CrtO（Synechocystis）48h仍主要积累海胆酮
结果2：在玉米黄质积累菌株中，表达crtW的菌株以虾青素为主要产物；表达crtO的菌株仍积累大量玉米黄质，仅微量虾青素（Rhodococcus CrtO可检测到虾青素和adonixanthin）
结论：CrtW型酮酶是唯一能高效合成虾青素的酮酶；crtW+crtZ组合是开发虾青素重组宿主的最佳基因候选；CrtO型酮酶不适用于虾青素合成
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核心内容

该研究通过在大肠杆菌中进行互补分析，系统比较了两种结构不同的β-胡萝卜素酮酶CrtO与CrtW的催化功能，旨在确定能够以玉米黄质为底物合成虾青素的最适酶基因。研究者分别在积累β-胡萝卜素或玉米黄质的大肠杆菌菌株中表达来自不同菌株的crtO和crtW基因，利用HPLC联用质谱分析产物积累情况。结果显示，来自Brevundimonas sp. SD212的CrtW在24小时内几乎完全将β-胡萝卜素转化为角黄素，而来自Rhodococcus erythropolis PR4的CrtO虽然也能生成角黄素，但48小时后仍有中间产物残留；来自Synechocystis sp. PCC6803的CrtO则主要停留在海胆酮阶段。在积累玉米黄质的菌株中，只有表达crtW的菌株能够以虾青素为主要类胡萝卜素，而表达crtO的菌株仍积累大量玉米黄质，仅检测到微量虾青素。该结果首次证明CrtO型酮酶无法接受3-羟基-β-紫罗兰酮环作为底物，而CrtW则是唯一能高效合成虾青素的酮酶，提示crtW与crtZ的组合是构建以虾青素为主要产物的重组微生物宿主的最有前景的基因选择。

创新点

首次通过互补分析证明CrtO型酮酶不能接受3-羟基-β-紫罗兰酮环作为底物，无法从玉米黄质合成虾青素；而CrtW型酮酶是唯一能高效合成虾青素的酮酶。

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli JM109 虾青素生物合成途径 crtO CrtO 催化 来自Rhodococcus erythropolis PR4，β-胡萝卜素酮酶，可催化β-胡萝卜素经海胆酮生成角黄素，但不能利用玉米黄质
Escherichia coli JM109 虾青素生物合成途径 crtO CrtO 催化 来自Synechocystis sp. PCC6803，主要催化β-胡萝卜素生成海胆酮，单酮化活性
Escherichia coli JM109 虾青素生物合成途径 crtW CrtW 催化 来自Brevundimonas sp. SD212，β-胡萝卜素酮酶，高效催化角黄素和虾青素合成，能利用玉米黄质
Escherichia coli JM109 虾青素生物合成途径 crtE, crtB, crtI, crtY, crtZ CrtE, CrtB, CrtI, CrtY, CrtZ 催化 来自Pantoea ananatis，用于合成β-胡萝卜素（crtE, crtB, crtI, crtY）和玉米黄质（另加crtZ）

关键发现

  1. CrtW（Brevundimonas sp. SD212）在24小时内几乎完全将β-胡萝卜素转化为角黄素
  2. CrtO（Rhodococcus erythropolis PR4）在48小时培养后主要产物为角黄素，但仍有残留中间产物
  3. CrtO（Synechocystis sp. PCC6803）在48小时仍主要积累海胆酮
  4. 在积累玉米黄质的大肠杆菌中，表达crtW的菌株以虾青素为主要类胡萝卜素，而表达crtO的菌株仍积累大量玉米黄质，仅产生微量虾青素（24小时培养中R. erythropolis CrtO可检测到虾青素和adonixanthin）。所有培养均在30°C，IPTG浓度0.5mM下进行，菌株12小时达到稳定期。

研究结论

细菌的crtW和crtZ基因组合是开发以虾青素为主要类胡萝卜素的重组宿主最有希望的基因候选；CrtO型酮酶不适用于虾青素合成途径。