Effective production of retinal from β-carotene using recombinant mouse β-carotene 15,15'-monooxygenase
- 作者
- Yeong-Su Kim, Nam-Hee Kim, Hye-Jung Kim, Jung-Kul Lee, Seon-Won Kim, Deok-Kun Oh
- 单位
- Department of Bioscience and Biotechnology, Konkuk University; Department of Chemical Engineering, Konkuk University; Division of Applied Life Science, Gyeongsang National University
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2007）
- DOI
- 10.1007/s00253-007-1118-2
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何高效生产视网膜醛（retinal），通过表达和优化重组小鼠β-胡萝卜素15,15'-单加氧酶的反应条件，解决以往产量低的问题。
研究策略
克隆小鼠β-胡萝卜素15,15'-单加氧酶基因在大肠杆菌中表达并纯化，系统优化pH、温度、去污剂浓度、底物浓度和酶量等反应条件，实现高浓度retinal的酶法生产。
核心内容
该研究以重组小鼠β-胡萝卜素15,15'-单加氧酶为工具，在大肠杆菌ER2566中表达并纯化该酶，系统优化了酶法生产视网膜醛的反应条件。通过His标签亲和和Resource Q离子交换两步纯化，获得比活达0.51 U/mg的纯化酶，较此前人源酶最高值提高51倍。最适反应条件为pH 9.0、37°C、β-胡萝卜素200 mg/L、Tween 40浓度5%（w/v）、酶量0.20 U/mL，在此条件下15小时视网膜醛产量达72 mg/L，转化率36%（w/w），较此前最高浓度0.12 mg/L提高约600倍。无酶对照显示视网膜醛在10小时和24小时后分别降解至75%和50%，表明酶促保护作用显著。该研究首次在大肠杆菌中实现小鼠β-胡萝卜素15,15'-单加氧酶的高水平活性表达，创下纯化酶比活和产物浓度的最高纪录，证明了该酶法体系在工业规模生产视网膜醛方面的潜力，为维生素A生物合成提供了高效可行的替代路线。
创新点
首次在大肠杆菌中成功表达具有活性的小鼠β-胡萝卜素15,15'-单加氧酶；纯化酶比活和retinal产量均为迄今最高；首次系统优化工业酶法生产retinal的反应条件。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli ER2566 | — | — | — | — | 重组表达宿主，用于表达小鼠β-胡萝卜素15,15'-单加氧酶 |
| — | β-胡萝卜素裂解通路（维生素A生物合成） | — | — | — | β-胡萝卜素被对称裂解为两分子all-trans-retinal |
| — | — | Bco1（β-胡萝卜素15,15'-单加氧酶基因，GenBank NM_021486，长1698 bp） | — | — | 从小鼠肝脏cDNA克隆，插入pET-24a(+)载体 |
| — | — | — | β-胡萝卜素15,15'-单加氧酶（EC 1.14.99.36） | 催化 | 纯化酶比活0.51 U/mg，催化β-胡萝卜素生成视网膜醛 |
关键发现
- 纯化酶经His标签亲和和Resource Q离子交换两步纯化，比活达0.51 U/mg（510 nmol mg-1 min-1），较此前人源酶最高值高51倍
- 最适反应条件为pH 9.0、37°C、β-胡萝卜素200 mg/L、Tween 40 5%（w/v）、酶量0.20 U/mL
- 在此条件下15小时retinal产量达72 mg/L，转化率36%（w/w），较此前最高浓度0.12 mg/L提高约600倍
- 无酶对照中retinal在10小时和24小时后分别降解至75%和50%
- 按消耗β-胡萝卜素95 mg/L计算理论产量为100 mg/L（转化率50%），实际损失约28 mg/L。
研究结论
本研究通过在大肠杆菌中高效表达重组小鼠β-胡萝卜素15,15'-单加氧酶并优化反应条件，实现了高浓度retinal的酶法生产，纯化酶比活和产量均为迄今最高，证明了该体系在工业酶法生产retinal中的应用潜力。