Co-ordinate expression of glycine betaine synthesis genes linked by the FMDV 2A region in a single open reading frame in Pichia pastoris

作者: Sanhong Wang, Quanhong Yao, Jianmin Tao, Yushan Qiao, Zhen Zhang
杂志: Applied Microbiology and Biotechnology（2007）
DOI: 10.1007/s00253-007-1222-3
所属领域: 代谢工程
关键词: 2A region of foot-and-mouth disease virusCoexpressionGlycine betaine synthesis genesPichia pastorisStress tolerance
阅读原文: 查看 PDF 原文

解决的核心问题

在毕赤酵母（Pichia pastoris）中实现多基因协同表达并提高菌株对环境胁迫（盐、甲醇、高温）的耐受性；同时避免多基因共表达中常见的转基因丢失、重排或沉默问题。

研究策略

将来自碱蓬（Suaeda salsa）的胆碱单加氧酶（CMO）和甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因通过口蹄疫病毒（FMDV）2A肽序列融合为单一开放阅读框，置于AOX1启动子控制下，转化毕赤酵母GS115，通过甲醇诱导实现两基因的协同表达。

研究路线图

100%

下载 .drawio 源文件

核心内容

该研究将来自碱蓬的胆碱单加氧酶（CMO）和甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因，利用口蹄疫病毒2A肽序列连接为单一开放阅读框，置于AOX1启动子控制下转化毕赤酵母GS115，以实现两基因的协同表达并提高菌株耐受性。经0.5%甲醇诱导96小时后，重组酵母A764和A765的CMO活性分别达19.57和21.87 U/mg蛋白，BADH活性为19.63和29.22 U/mg蛋白，较对照（CMO 0.49 U/mg，BADH 0.67 U/mg）提升约45倍和44倍；甜菜碱含量最高达4.82 mg/g细胞沉淀，较对照提高28至35倍。SDS-PAGE证实了约49 kDa和54 kDa的CMO与BADH蛋白有效表达。重组菌株可耐受1.2 mol/L NaCl、7%甲醇，在36°C下生长显著优于对照。结果表明FMDV 2A肽能在毕赤酵母中介导多蛋白有效切割并产生有活性的酶，导入甜菜碱合成通路可显著增强菌株对盐、甲醇和高温等胁迫的耐受性，为毕赤酵母中多基因协同表达提供了可行策略。

创新点

首次在毕赤酵母中利用FMDV 2A序列实现多基因单ORF共表达；证明植物来源的甜菜碱合成途径可在酵母中功能表达，显著提高重组酵母的盐、甲醇和高温耐受性。

研究对象（4）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Pichia pastoris GS115	甘氨酸甜菜碱合成途径	CMO (choline monooxygenase)	胆碱单加氧酶	催化	来源于Suaeda salsa，催化胆碱氧化为甜菜碱醛；编码序列1329 bp，编码442个氨基酸
Pichia pastoris GS115	甘氨酸甜菜碱合成途径	BADH (betaine aldehyde dehydrogenase)	甜菜碱醛脱氢酶	催化	来源于Suaeda salsa，催化甜菜碱醛氧化为甘氨酸甜菜碱；编码序列1506 bp，编码501个氨基酸
Pichia pastoris GS115	异源蛋白表达	FMDV 2A region	口蹄疫病毒2A寡肽	调控	约20个氨基酸的2A肽，连接CMO和BADH，通过核糖体跳跃介导多蛋白共翻译切割
Pichia pastoris GS115	甲醇代谢	AOX1 promoter	醇氧化酶1启动子	调控	来自毕赤酵母，用于驱动融合基因CMO-2A-BADH的甲醇诱导表达

关键发现

经0.5%甲醇诱导96 h后，重组酵母A764和A765中CMO活性分别为19.57和21.87 U/mg蛋白，BADH活性分别为19.63和29.22 U/mg蛋白，分别比对照YPIC3（CMO活性0.49 U/mg，BADH活性0.67 U/mg）高约45倍和44倍
重组酵母A767的CMO和BADH活性较低（4.30和4.56 U/mg），但仍显著高于对照。甜菜碱含量方面，重组酵母A764、A765、A767的GB含量分别为4.51、4.82、3.93 mg/g细胞沉淀，而对照YPIC3仅为0.14 mg/g，提高了28–35倍。SDS-PAGE显示A764和A765表达约49 kDa和54 kDa的CMO和BADH蛋白。重组酵母在含0.5%甲醇的YPD培养基上可耐受1.2 mol/L NaCl，甚至在1.5 mol/L NaCl下可少量生长
耐受7%甲醇
在36°C高温下生长明显优于对照。

研究结论

FMDV 2A肽在毕赤酵母中能介导CMO-2A-BADH多蛋白的有效'切割'，产生有活性的CMO和BADH，实现两基因的协调表达；甜菜碱合成通路导入可显著提高毕赤酵母对盐、甲醇和高温等环境胁迫的耐受性，2A多蛋白系统有望用于毕赤酵母中多个功能蛋白的共同表达。