Expression of Clostridium acetobutylicum butanol synthetic genes in Escherichia coli
- 作者
- Masayuki Inui, Masako Suda, Sakurado Kimura, Kaori Yasuda, Hiroaki Suzuki, Hiroshi Toda, Shogo Yamamoto, Shohei Okino, Nobuaki Suzuki, Hideaki Yukawa
- DOI
- 10.1007/s00253-007-1257-5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
梭菌属为严格厌氧菌，生长缓慢、丁醇产率低，且溶剂生产能力易因质粒丢失而不稳定，需要开发基于快生好氧微生物的新型丁醇生产菌株与工艺。
研究策略
将丙酮丁醇梭菌 ATCC 824 的丁醇合成途径基因（thiL、hbd、crt、bcd-etfB-etfA、adhe1/adhe）置于 tac 启动子控制下，构建重组质粒并转化大肠杆菌 JM109，通过酶活测定和静息细胞发酵验证丁醇生产。
核心内容
本研究将丙酮丁醇梭菌ATCC 824的丁醇合成途径基因（thiL、hbd、crt、bcd-etfB-etfA及adhe1/adhe）置于tac启动子控制下，构建重组质粒并转化大肠杆菌JM109，通过酶活测定和静息细胞发酵验证丁醇生产。结果显示，THL、HBD、CRT活性分别比对照高约30、20、500倍，其中THL比活为2.9-4.3 U/mg，HBD为2.4-2.5 U/mg，CRT为16.0-19.0 U/mg。研究首次在大肠杆菌中检出丁酰辅酶A脱氢酶（BCD）活性，但该活性必须在严格厌氧条件下制备细胞提取物和测定，且电子转移黄素蛋白ETF-A/ETF-B与bcd共表达是活性必需的。在发酵中，表达adhe的菌株BUT2培养后产生16.2 mM（1,200 mg/L）丁醇，葡萄糖产率6.1%，明显优于表达adhe1的BUT1（4.2 mM，产率1.4%），表明adhe更适于丁醇生产。这项工作证明利用快生兼性厌氧宿主表达梭菌丁醇途径可稳定生产丁醇，为后续通过敲除副产物途径提高产量奠定了基础。
创新点
首次在大肠杆菌中检测到来自丙酮丁醇梭菌的丁酰辅酶A脱氢酶（BCD）活性，证明需在严格厌氧条件下制备细胞提取物和测定；首次证明 ETF-A/ETF-B 对 BCD 活性必不可少且必须与 bcd 在同一细胞中共表达；构建了能利用葡萄糖生产丁醇的大肠杆菌菌株 BUT1 和 BUT2；实现了由需氧预培养微生物携带严格厌氧菌基因进行丁醇生产。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM109 | 丁醇合成途径 | thiL | 乙酰辅酶A乙酰转移酶 (THL) | 催化 | 催化乙酰辅酶A缩合为乙酰乙酰辅酶A |
| Escherichia coli JM109 | 丁醇合成途径 | hbd | β-羟基丁酰辅酶A脱氢酶 (HBD) | 催化 | 催化乙酰乙酰辅酶A还原为β-羟基丁酰辅酶A |
| Escherichia coli JM109 | 丁醇合成途径 | crt | 3-羟基丁酰辅酶A脱水酶 (CRT) | 催化 | 催化β-羟基丁酰辅酶A脱水生成巴豆酰辅酶A |
| Escherichia coli JM109 | 丁醇合成途径 | bcd | 丁酰辅酶A脱氢酶 (BCD) | 催化 | 催化巴豆酰辅酶A还原为丁酰辅酶A；需厌氧条件下检测活性 |
| Escherichia coli JM109 | 丁醇合成途径 | etfA, etfB | 电子转移黄素蛋白 (ETF-A/ETF-B) | 能量供给 | 为 BCD 催化提供电子传递，且需与 bcd 在同一细胞中共表达 |
| Escherichia coli JM109 | 丁醇合成途径 | adhe1 | 丁醛/丁醇脱氢酶 (BYDH/BDH) | 催化 | 双功能酶；对丁酰辅酶A的特异性低于 adhe 产物 |
| Escherichia coli JM109 | 丁醇合成途径 | adhe | 丁醛/丁醇脱氢酶 (BYDH/BDH) | 催化 | 双功能酶；对丁酰辅酶A特异性较高，有利于丁醇生成 |
关键发现
- 成功表达了六步丁醇合成途径酶。酶活测定显示，BUT1/BUT2 中 THL、HBD、CRT 活性分别比对照高约
- 20、500 倍；色谱法测得 THL 比活为
- 9-4.3 U/mg，HBD 为
- 4-2.5 U/mg，CRT 为
- 0-19.0 U/mg。BCD 活性首次在大肠杆菌中检出，BUT1 为
- 010 U/mg，BUT2 为
- 019 U/mg，而 JM109 未检出；去除 etfA/etfB 后活性丧失，单独表达 bcd 或 ETF 均无 BCD 活性。BYDH 活性在 BUT2 中为
- 024 U/mg（较 JM109 高 12 倍），BUT1 中仅
- 0028 U/mg；adhe 产物对丁酰辅酶A的特异性高于 adhe1 产物。丁醇生产实验中，BUT1 培养 60 h 后产生
- 2 mM（320 mg/L）丁醇和
- 1 mM（540 mg/L）丁酸，对葡萄糖产率分别为
- 4% 和
- 3%；BUT2 产生
- 2 mM（1,200 mg/L）丁醇和
- 2 mM（100 mg/L）丁酸，产率分别为
- 1% 和
- 4%。
研究结论
在大肠杆菌中表达丙酮丁醇梭菌的丁醇合成基因可实现在厌氧条件下从葡萄糖生产丁醇，其中 adhe 比 adhel 更适合丁醇生产；BCD 活性需 ETF 复合物并在严格厌氧条件下检测。该策略为利用快速生长的兼性厌氧宿主生产丁醇提供了新途径，未来可通过敲除副产物相关基因（如 ldhA、fdhF、frdABCD）进一步提高产量。