Effect of anaerobic promoters on the microaerobic production of polyhydroxybutyrate (PHB) in recombinant Escherichia coli
- 作者
- Xiao-Xing Wei, Zhen-Yu Shi, Mei-Qing Yuan, Guo-Qiang Chen
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2009）
- DOI
- 10.1007/s00253-008-1816-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
微好氧或厌氧条件下重组大肠杆菌中PHB合成基因表达下调导致PHB含量低，需要筛选有效的厌氧启动子来驱动phbCAB操纵子，实现低氧条件下的高效PHB生产。
研究策略
从大肠杆菌基因组中克隆9个厌氧启动子，分别构建于Ralstonia eutropha的phbCAB操纵子上游，在静置培养条件下筛选最有效的启动子；进一步在乙酸途径缺失突变株（Δpta、ΔackA）中利用P_adhE启动子增强表达，并在5.5 L发酵罐中进行微好氧批式发酵验证。
核心内容
针对重组大肠杆菌在微好氧条件下PHB合成基因表达不足的问题，该研究从基因组中克隆了9个厌氧启动子，分别驱动Ralstonia eutropha的phbCAB操纵子，在静置培养下筛选出最有效的启动子P_adhE。携带P_adhE的菌株JM109(pWYC09)静置培养48小时PHB含量达48%细胞干重，较天然启动子提高60%。进一步在乙酸合成途径突变株中测试，Δpta菌株JW2294(pWYC09)静置培养PHB含量达67.4%±2.4%，且P_adhE活性较野生型提高3-5倍。在5.5 L发酵罐微好氧批式培养24小时，JW2294(pWYC09)的细胞干重为7.75 g/L，PHB含量64.3%（5.0 g/L），均优于野生型对照。值得注意的是，微好氧条件下PHB重均分子量最高达到14.49×10⁶ Da，远高于好氧培养的2.76×10⁶ Da。该研究首次将厌氧启动子应用于微好氧PHB生产，结合pta缺失突变实现了高含量超高分子量PHB的合成，为低能耗PHB生产工艺提供了可行策略。
创新点
首次将厌氧启动子用于微好氧/厌氧条件下PHB生产；鉴定出P_adhE为最有效的厌氧启动子；与pta缺失突变结合使PHB含量达67%；发现微好氧条件下PHB分子量大幅提高。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli JM109 | PHB合成 | phbCAB | PhaC/PhaA/PhaB | 催化 | 来自Ralstonia eutropha，由P_adhE启动子驱动，静置培养PHB含量48% |
| E. coli JW2294 (Δpta) | PHB合成 | phbCAB | PhaC/PhaA/PhaB | 催化 | 乙酸途径突变株，静置培养PHB含量67.4%，发酵罐64.3% |
| E. coli JW2293 (ΔackA) | PHB合成 | phbCAB | PhaC/PhaA/PhaB | 催化 | 乙酸途径突变株，静置培养PHB含量58.6% |
| E. coli BW25113 | PHB合成 | phbCAB | PhaC/PhaA/PhaB | 催化 | 野生型菌株，携带pWYC09静置培养PHB含量50.2% |
| E. coli | 混合酸发酵 | adhE | 乙醇脱氢酶 (ADH) | 催化 | 其启动子P_adhE被用于驱动phbCAB，厌氧条件下活性高 |
| E. coli | 乙酸合成 | pta | 磷酸转乙酰酶 | 催化 | 基因缺失增强P_adhE活性，减少乙酸副产物 |
| E. coli | 乙酸合成 | ackA | 乙酸激酶 | 催化 | 基因缺失增强P_adhE活性 |
| E. coli | PHB合成 | P_adhE | — | 调控 | 乙醇脱氢酶基因的厌氧启动子，用于驱动phbCAB表达 |
关键发现
- 重组E. coli JM109(pWYC09)（P_adhE驱动phbCAB）静置培养48h后PHB含量达48%（细胞干重），较天然启动子pBHR68的30%提高60%
- 乙酸途径缺失突变株E. coli JW2294（Δpta）携带pWYC09静置培养PHB含量达67.4%±2.4%
- 5-L发酵罐微好氧批式培养24h，JW2294(pWYC09)的CDW为7.75 g/L，PHB含量64.3%（5.0 g/L），而野生型BW25113(pWYC09)CDW为6.72 g/L，PHB含量45.5%（3.0 g/L）
- Δpta和ΔackA突变株中P_adhE活性比野生型高3-5倍
- 微好氧静置培养下PHB重均分子量最高达14.49×10^6 Da（JW2294/pWYC09），远高于好氧摇瓶培养的2.76×10^6 Da（BW25113/pWYC09）。
研究结论
厌氧启动子P_adhE能有效驱动phbCAB基因在微好氧/厌氧条件下高水平表达，结合乙酸途径pta缺失突变，可显著提高PHB含量（67.4%）并获得超高分子量PHB，为低能耗PHB生产提供了新策略。