Biofuel production in Escherichia coli: the role of metabolic engineering and synthetic biology
- 作者
- James M. Clomburg, Ramon Gonzalez
- DOI
- 10.1007/s00253-010-2446-1
- 所属领域
- 代谢工程；合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
利用大肠杆菌作为底盘细胞，通过代谢工程和合成生物学手段，实现多种生物燃料（乙醇、高级醇、脂肪酸衍生燃料、异戊二烯衍生燃料等）的高效生产，同时解决不同碳源（糖、甘油、脂肪酸）的利用效率、氧化还原平衡、产物抑制等问题，以替代化石燃料。
研究策略
系统综述了大肠杆菌生产生物燃料的工程策略，包括：通过改造PTS系统和碳代谢物阻遏相关基因实现混合糖共利用；利用高还原性碳源（甘油、脂肪酸）提高产物理论产率；重构发酵途径（如梭菌丁醇/异丙醇途径）和非发酵途径（氨基酸合成途径、脂肪酸/异戊二烯途径）生产候选燃料；采用蛋白质工程（如AdhE定点突变）和系统生物学方法优化菌株性能。
核心内容
该综述系统总结了利用大肠杆菌作为底盘生产多种生物燃料的代谢工程与合成生物学策略。针对混合糖利用受限的问题，通过失活PTS系统、引入CRP*突变或敲除mgsA基因解除碳代谢物阻遏，实现葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等混合糖的同步共利用；针对产物理论产率受限，开发了基于甘油和脂肪酸等高还原性碳源的生产平台，例如利用脂肪酸产乙醇的理论产率可达1.38 g/g，相当于葡萄糖的2.7倍。文中还综述了重构梭菌异源途径合成异丙醇和1-丁醇、延伸氨基酸合成途径生产异丁醇等高级醇、以及工程化脂肪酸和甲羟戊酸途径生成脂肪醇、脂肪酸乙酯和烯烃等燃料分子的策略。关键结果包括：在表达运动发酵单胞菌pdc和adhB的菌株中乙醇占发酵产物95%，KO11菌株木糖发酵乙醇滴度达60 g/L；利用甘油产乙醇速率最高达4.6 mmol/L/h；异丁醇产量达22 g/L。该工作表明，通过系统整合途径重构、蛋白质工程与辅因子调控，大肠杆菌已成为生产多种先进生物燃料的多能平台，但多数产物滴度仍待提升。
创新点
1. 利用PTS失活、CRP*突变、mgsA缺失等策略突破碳代谢物阻遏，实现葡萄糖/木糖等混合糖同步利用；2. 开发基于甘油和脂肪酸的高还原性碳源平台，显著提高乙醇等产物的理论产率（如脂肪酸产乙醇理论产率1.38 g/g，是葡萄糖的2.7倍）；3. 通过表达异源梭菌途径在大肠杆菌中实现异丙醇和1-丁醇的生产；4. 利用氨基酸生物合成途径延伸合成异丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇及非天然高级醇；5. 工程化甲羟戊酸途径和脂肪酸合成途径生产异戊烯醇、脂肪酸乙酯、脂肪醇和烯烃等新型生物燃料。
研究对象（23）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 乙醇发酵（异源） | pdc, adhB | 丙酮酸脱羧酶, 乙醇脱氢酶 | 催化 | 来自Zymomonas mobilis，构建pet操纵子，使乙醇占发酵产物95% |
| Escherichia coli | 丙酮酸脱氢酶途径 | pdhR-aceEF-lpd | 丙酮酸脱氢酶复合物 | 催化 | pdh操纵子突变使PDH在厌氧条件下表达，实现同型乙醇发酵 |
| Escherichia coli | 甘油代谢 | gldA, dhaKLM | 甘油脱氢酶, PEP依赖性二羟丙酮激酶 | 催化 | 过表达提高甘油利用速率，用于厌氧甘油发酵 |
| Escherichia coli | 脂肪酸β-氧化 | fadD, fadE, fadA, fadB | 脂肪酰-CoA合成酶, 脂酰-CoA脱氢酶, 3-酮脂酰-CoA硫解酶, 烯脂酰-CoA水合酶 | 催化 | 参与脂肪酸降解为乙酰-CoA |
| Escherichia coli | 脂肪酸转运 | fadL | 长链脂肪酸外膜转运蛋白 | 转运 | 负责长链脂肪酸跨外膜转运 |
| Escherichia coli | 短链脂肪酸利用 | atoD, atoA, atoB | 乙酰-CoA:乙酰乙酰-CoA转移酶, 乙酰-CoA酰基转移酶 | 催化 | atoDAEB操纵子，负责短链脂肪酸代谢 |
| Escherichia coli | 碳代谢物阻遏/PTS | ptsG, ptsHI, crr | 葡萄糖特异性PTS组分EIIBC, EI, HPr, EIIA | 转运 | PTS缺陷部分解除CCR，实现糖共利用 |
| Escherichia coli | 葡萄糖转运补充途径 | galP, glk | 半乳糖透性酶, 葡糖激酶 | 转运 | 在PTS突变株中激活替代葡萄糖转运和磷酸化 |
| Escherichia coli | 碳代谢物阻遏调控 | crp | cAMP受体蛋白（CRP*） | 调控 | 表达不依赖cAMP的CRP*突变体以解除阻遏 |
| Escherichia coli | 甲基乙二醛支路 | mgsA | 甲基乙二醛合酶 | 调控 | 缺失该基因促进葡萄糖/木糖共利用 |
| Escherichia coli | 异丙醇合成 | thl, ctfAB, adc, adh | 乙酰-CoA乙酰转移酶, 乙酰乙酰-CoA:乙酸CoA转移酶, 乙酰乙酸脱羧酶, 二级醇脱氢酶 | 催化 | 来自Clostridium，合成异丙醇，最高4.9 g/L |
| Escherichia coli | 1-丁醇合成（发酵型） | thl, hbd, crt, bcd, etfAB, adhE2 | β-羟基丁酰-CoA脱氢酶, 巴豆酸酶, 丁酰-CoA脱氢酶等 | 催化 | 重构梭菌丁醇途径，最高1.2 g/L |
| Escherichia coli | 缬氨酸合成/异丁醇 | alsS, ilvC, ilvD, kivd, ADH2 | 乙酰乳酸合酶, 酮醇酸还原异构酶, 二羟酸脱水酶, 酮异戊酸脱羧酶, 乙醇脱氢酶 | 催化 | 非发酵途径生产异丁醇，22 g/L |
| Escherichia coli | 柠苹酸途径/1-丙醇和1-丁醇 | cimA (突变体), leuABCD, kivd, ADH | 柠苹酸合酶, 2-异丙基苹果酸合酶等 | 催化 | 产生1-丙醇3.5 g/L，1-丁醇约0.5 g/L |
| Escherichia coli | 苏氨酸/异亮氨酸合成/2-甲基-1-丁醇 | thrABC, ilvGM (St), ilvC, ilvD, ilvA (Cg), kivd, ADH | 天冬氨酸激酶, 苏氨酸合酶, 苏氨酸脱氨酶等 | 催化 | 产2-甲基-1-丁醇1.25 g/L |
| Escherichia coli | 缬氨酸/亮氨酸合成/3-甲基-1-丁醇 | ilvIHCD, leuABCD (leuA抗反馈), kivd, ADH | 乙酰羟酸合酶, 异丙基苹果酸合酶等 | 催化 | 产3-甲基-1-丁醇1.28 g/L |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径/异戊烯醇 | ERG12, ERG8, MVD1, tHMGR, idi, nudF (Bs) | 甲羟戊酸激酶, 磷酸甲羟戊酸激酶, 焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶, HMG-CoA还原酶, 异戊烯基焦磷酸异构酶, 异戊烯醇激酶 | 催化 | 产异戊烯醇112 mg/L |
| Escherichia coli | 脂肪酸乙酯合成 | pdc, adhB (Zm), atfA (Ab) | 丙酮酸脱羧酶, 乙醇脱氢酶, 脂酰转移酶 | 催化 | 以葡萄糖和油酸为底物产FAEE 1.3 g/L |
| Escherichia coli | 脂肪醇合成 | fadD, acrI (Ab), accABCD, tesA | 脂酰-CoA合成酶, 脂酰-CoA还原酶, 乙酰-CoA羧化酶, 硫酯酶 | 催化 | 产脂肪醇0.2-0.5 mg/L |
| Escherichia coli | 烯烃合成 | oleABCD (Sm), fadD, tesA | oleA-D蛋白, 脂酰-CoA合成酶, 硫酯酶 | 催化 | 产烯烃7.5 mg/L，过表达后32 mg/L |
| Escherichia coli | 乙醇发酵（脂肪酸底物） | adhE (Glu568Lys) | 乙醇脱氢酶AdhE* | 催化 | 点突变使AdhE在有氧条件下有活性，用于脂肪酸产乙醇 |
| Escherichia coli | 丁醇途径辅因子 | fdh1 (Sc), gapA | 甲酸脱氢酶, 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 | 催化 | 增加NADH和糖酵解通量，提高丁醇产量至580 mg/L |
| Escherichia coli | 竞争途径敲除 | ldhA, adhE, frdBC, pta, fur | 乳酸脱氢酶, 乙醇脱氢酶, 富马酸还原酶, 磷酸转乙酰酶, 丙酮酸甲酸裂解酶 | 催化 | 敲除以减少副产物，提高丁醇产量 |
关键发现
- 在PTS突变株中过表达galP和glk可恢复葡萄糖转运并解除CCR，实现糖共利用；mgsA缺失使乙醛生产菌株能同时利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖。
- 表达Z. mobilis的pdc和adhB后，乙醇占发酵产物95%；菌株KO11在丰富培养基中以100%理论产率生产乙醇，木糖发酵时LY01菌株乙醇滴度达60 g/L（产率85%）。
- 经改造的大肠杆菌可将9%（w/v）木糖在48小时内转化为4%（w/v）乙醇；Kim等人仅用天然基因获得82%产率的同型乙醇发酵。
- 利用甘油生产乙醇和氢/甲酸，实现接近理论最大值的1:1共生产，乙醇生产速率达4.6 mmol/L/h（与氢共产）或3.58 mmol/L/h（与甲酸共产，甲酸3.18 mmol/L/h）；Trinh等将40 g/L甘油转化为乙醇，产率为理论值的90%。
- 利用脂肪酸生产乙醇，通过表达有氧活性AdhE*（Glu568Lys），乙醇产率达1.08 g/g脂肪酸，是葡萄糖理论产率（0.51 g/g）的两倍以上。
- 异丙醇最高产量4.9 g/L（Hanai等）；1-丁醇通过表达梭菌途径达1.2 g/L，通过密码子优化和辅因子工程达580 mg/L。
- 非发酵途径：异丁醇产量22 g/L（表1），1-丙醇3.5 g/L，1-丁醇0.5 g/L（柠苹酸途径）；2-甲基-1-丁醇1.25 g/L（24小时），3-甲基-1-丁醇1.28 g/L（28小时）。
- 异戊烯醇112 mg/L（43小时）；脂肪酸乙酯（FAEE）1.3 g/L；脂肪醇0.2-0.5 mg/L（过表达后可提高）；烯烃7.5 mg/L，过表达fadD/tesA并敲除fadE后增至32 mg/L。
- 乙醇耐受性限值约35 g/L（大肠杆菌）而酵母可达90 g/L；通过定向进化获得的LY01能发酵木糖产60 g/L乙醇。
研究结论
通过代谢工程和合成生物学方法，大肠杆菌已被成功改造为多能生物催化剂，能利用多种可再生碳源（糖、甘油、脂肪酸）生产包括乙醇、异丙醇、1-丁醇、异丁醇、脂肪醇/酯、烯烃和异戊二烯衍生物在内的多种候选生物燃料。尽管多数产物滴度仍需提高，但已证明技术可行性。未来结合系统生物学工具（组学、通量分析）和合成生物学新工具，可进一步提高产量、产率与生产强度，扩大产物谱，推动生物燃料的工业化生产。