Bacillus methanolicus pyruvate carboxylase and homoserine dehydrogenase I and II and their roles for L-lysine production from methanol at \(50^{\circ}\mathrm{C}\)
- 作者
- Trygve Brautaset, Oyvind M. Jakobsen, Kristin F. Degnes, Roman Netzer, Ingemar Nærdal, Anne Krog, Rick Dillingham, Michael C. Flickinger, Trond E. Ellingsen
- 单位
- Department of Biotechnology, SINTEF Materials and Chemistry, 7465 Trondheim, Norway; Department of Biotechnology, Norwegian University of Science and Technology, 7491 Trondheim, Norway; BioTechnology Institute, Department of Biochemistry, Molecular Biology and Biophysics, University of Minnesota, St. Paul, MN 55108, USA; Chemical and Biomolecular Engineering, North Carolina State University, Raleigh, NC 27695-7928, USA
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2010）
- DOI
- 10.1007/s00253-010-2559-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析Bacillus methanolicus中丙酮酸羧化酶(PC)和高丝氨酸脱氢酶(HD)（hom-1和hom-2）在从甲醇生产L-赖氨酸过程中的作用，评估它们是否是L-赖氨酸过量生产的关键瓶颈。
研究策略
克隆并表征pyc、hom-1和hom-2基因；构建PC过表达及P455S突变体表达载体；利用AEC抗性突变株M168-20和经典突变株NOA2#13A52-8A66进行补料分批发酵；通过定量PCR分析转录水平；结合遗传突变和生化活性分析，探究这些基因对L-赖氨酸/谷氨酸生产的影响。
核心内容
该研究以能够利用甲醇生长的嗜热芽孢杆菌Bacillus methanolicus MGA3为对象，系统解析了丙酮酸羧化酶（PC）和高丝氨酸脱氢酶（hom-1和hom-2）在L-赖氨酸过量生产中的角色。研究者克隆并表征了pyc、hom-1和hom-2基因，发现该菌拥有两个功能性高丝氨酸脱氢酶基因，其中hom-1是AEC抗性和L-赖氨酸过量生产的关键靶点：hom-1突变株M168-20在补料分批发酵中产生11 g/L L-赖氨酸，而回补hom-1后产量恢复至野生型水平，hom-2仅能部分补偿。经典突变株NOA2#13A52-8A66产65 g/L L-赖氨酸，其pyc转录水平提高约3倍。过表达PC虽能显著降低L-谷氨酸产量（野生型中体积产量降至对照的53%），却未能提升L-赖氨酸产量，表明OAA前体供应并非赖氨酸合成的主要瓶颈。最大L-赖氨酸生产率达1.6 g/L/h。这些结果意味着进一步代谢工程应聚焦于天冬氨酸至赖氨酸途径的改造，同时通过增强PC活性抑制谷氨酸支路以优化产量分配。
创新点
首次从甲基营养菌中克隆并表征丙酮酸羧化酶基因pyc；首次报道Bacillus属具有两个功能性高丝氨酸脱氢酶基因（hom-1和hom-2）；证明hom-1是AEC抗性和L-赖氨酸过量生产的关键靶点；发现PC过表达可显著降低L-谷氨酸产量，但未提高L-赖氨酸产量，表明OAA前体供应并非主要瓶颈。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus methanolicus MGA3 | 回补途径/丙酮酸代谢 | pyc | 丙酮酸羧化酶(PC) | 催化 | 催化丙酮酸羧化为草酰乙酸(OAA)，提供L-赖氨酸/谷氨酸共同前体；过表达使PC活性提高约7倍（490 vs 70 nmol/min/mg蛋白），但未提高L-赖氨酸产量，反而降低L-谷氨酸产量 |
| Bacillus methanolicus MGA3 | 天冬氨酸家族氨基酸生物合成 | hom-1 | 高丝氨酸脱氢酶I(HD I) | 催化 | 控制L-赖氨酸生物合成分支点；转录受L-苏氨酸强烈抑制（33倍）；突变可导致AEC抗性和L-赖氨酸过量生产 |
| Bacillus methanolicus MGA3 | 天冬氨酸家族氨基酸生物合成 | hom-2 | 高丝氨酸脱氢酶II(HD II) | 催化 | 第二个功能性HD，与hom-1共享32%序列同一性；转录受L-甲硫氨酸抑制14倍；在L-赖氨酸过量生产中的作用次要 |
| Bacillus methanolicus M168-20 | 天冬氨酸家族氨基酸生物合成 | hom-1 | 高丝氨酸脱氢酶I(HD I) | 催化 | 携带染色体点突变D120N和V397F，导致HD活性丧失，赋予AEC抗性；该菌株L-赖氨酸产量11 g/L |
| Bacillus methanolicus NOA2#13A52-8A66 | 天冬氨酸家族氨基酸生物合成 | hom-1 | 高丝氨酸脱氢酶I(HD I) | 催化 | 携带V262F突变；同时pyc转录水平升高3倍，L-赖氨酸产量65 g/L |
| Bacillus methanolicus M168-20 | 回补途径/丙酮酸代谢 | pyc | 丙酮酸羧化酶(PC) | 催化 | 过表达PC及P455S突变体，L-赖氨酸产量无提升，但L-谷氨酸产量显著降低 |
| Escherichia coli Gif102 | 天冬氨酸家族氨基酸生物合成 | hom-1, hom-2 | 高丝氨酸脱氢酶I和II | 催化 | 用于功能互补实验，证明hom-1和hom-2均编码活性HD蛋白 |
关键发现
- 野生型MGA3在优化补料分批发酵中分泌0.4 g/L L-赖氨酸和59 g/L L-谷氨酸
- hom-1突变株M168-20产生11 g/L L-赖氨酸和69 g/L L-谷氨酸
- 经典突变株NOA2#13A52-8A66产生65 g/L L-赖氨酸和28 g/L L-谷氨酸，且pyc转录水平提高3倍（相对水平3.0±0.2 vs 1.0±0.2）
- PC过表达使M168-20的最大体积L-谷氨酸产量降至对照的75%（L-谷氨酸产率降至79%），P455S突变体分别降至62%和75%
- 在野生型MGA3中PC过表达使L-谷氨酸体积产量和产率分别降至对照的53%和70%，L-丙氨酸产量降低约50%
- 摇瓶实验中M168-20(pHP13) L-赖氨酸产量为170 mg/L，比MGA3(pHP13)的7 mg/L高24倍
- 回补hom-1使M168-20的L-赖氨酸产量恢复至野生型水平（10 mg/L），而回补hom-2仅略微下降（140 mg/L）
- 最大L-赖氨酸生产率为1.6 g/L/h。
研究结论
hom-1基因是B. methanolicus中AEC抗性和L-赖氨酸过量生产的关键靶点；PC活性对控制从甲醇生产L-谷氨酸起重要作用；草酰乙酸(OAA)前体供应并非L-赖氨酸过量生产的主要瓶颈；进一步代谢工程应重点改造天冬氨酸到L-赖氨酸的生物合成途径，同时通过PC过表达减少L-谷氨酸合成可能有助于最大化L-赖氨酸产量。