Identification of novel genes responsible for ethanol and/or thermotolerance by transposon mutagenesis in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Hyun-Soo Kim, Na-Rae Kim, Jungwoo Yang, Wonja Choi
- 单位
- Department of Life Science, College of Natural Sciences, Ewha Womans University; Division of Life and Pharmaceutical Sciences, Ewha Womans University; Microbial Resources Research Center, College of Natural Sciences, Ewha Womans University
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2011）
- DOI
- 10.1007/s00253-011-3298-z
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定赋予酿酒酵母乙醇耐受性和/或热耐受性的新基因，以改善工业乙醇生产菌株的性能。
研究策略
通过转座子介导的随机突变构建酵母突变体库，筛选乙醇和/或热耐受菌株；结合转座子插入位点分析、Northern blot验证基因表达变化，并利用单基因敲除库和互补/过表达实验确认基因功能。
核心内容
该研究通过转座子随机突变构建酿酒酵母突变体库，从约3000个突变体中筛选出5株耐受15%乙醇的菌株（Tn1-Tn5），其中Tn2和Tn3同时耐受42°C高温。结合插入位点分析、Northern blot及单基因敲除验证，鉴定出7个与乙醇耐受相关的新基因（CMP2、IMD4、SSK2、PPG1、DLD3、PAM1、MSN2），其中SSK2、PPG1和PAM1同时参与热耐受。研究发现转座子插入调控区导致基因下调而非完全敲除，例如Tn1中CMP2和IMD4表达分别下降约10%和20%，Tn2中SSK2和PPG1分别下降约20%和50%，这一机制在传统ORF敲除库中难以捕获。在含30%葡萄糖和6%初始乙醇的培养基中，5个突变株生长更快且产乙醇更高；42°C发酵条件下，Tn2和Tn3的最大乙醇浓度分别达到对照的1.5倍和2.4倍。这些基因作为负调控因子，其下调或敲除可增强酵母的乙醇及热耐受性，为工业乙醇生产菌株的理性改造提供了新靶点。
创新点
鉴定出7个与乙醇耐受相关的新基因（CMP2、IMD4、SSK2、PPG1、DLD3、PAM1、MSN2），其中3个（SSK2、PPG1、PAM1）同时与热耐受相关；发现转座子插入调控区导致基因下调，这在以ORF敲除为主的传统库中难以获得。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae L3262 | 钙调磷酸酶信号通路 | CMP2 | Calcineurin A (催化亚基异构体) | 调控 | 编码钙调磷酸酶催化亚基，下调其表达赋予乙醇耐受性；Tn1中转座子插入CMP2和IMD4终止子区域，CMP2表达降低约10%。 |
| Saccharomyces cerevisiae L3262 | GMP生物合成 | IMD4 | 肌苷-5'-单磷酸脱氢酶 (IMPDH) 同工酶 | 催化 | 催化IMP向XMP转化，即GMP生物合成第一步；下调表达与乙醇耐受性相关，Tn1中IMD4表达降低约20%。 |
| Saccharomyces cerevisiae L3262 | HOG1 MAPK信号通路 | SSK2 | MAPKKK Ssk2p | 调控 | HOG1途径的MAPKKK，其下调或敲除赋予乙醇和热耐受性；Tn2中SSK2表达降低约20%。 |
| Saccharomyces cerevisiae L3262 | 糖原积累/信号转导 | PPG1 | 推定丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶 Ppg1p | 调控 | 与糖原积累相关，其下调或敲除同时赋予乙醇和热耐受性；Tn2中PPG1表达降低约50%。 |
| Saccharomyces cerevisiae L3262 | 线粒体损伤应答/乙醛酸循环 | DLD3 | D-乳酸脱氢酶 Dld3p | 催化 | 催化D-乳酸氧化，属于逆行调节子；其下调赋予乙醇耐受性，Tn4中转座子插入RMD6和DLD3之间，DLD3表达降低约25%。 |
| Saccharomyces cerevisiae L3262 | 细胞形态调控/未知功能 | PAM1 | Pam1p | 调控 | 功能未知，过表达抑制生长并诱导菌丝表型；其ORF被转座子破坏，敲除赋予乙醇和热耐受性。 |
| Saccharomyces cerevisiae L3262 | 应激反应（STRE介导） | MSN2 | 锌指转录因子 Msn2p | 调控 | 应激反应转录因子，与Msn4p部分冗余；其ORF被转座子破坏，敲除后通过上调MSN4和STRE介导基因（CTT1、HSP12）增强乙醇耐受性。 |
关键发现
- 从约3000个转座子突变体中筛选出5株耐受15%乙醇的菌株（Tn1-5），其中Tn2和Tn3同时耐受42°C高温。Northern blot显示Tn1中CMP2和IMD4表达分别下降约10%和20%
- Tn2中SSK2和PPG1分别下降约20%和50%
- Tn4中DLD3下降约25%，而RMD6不变
- Tn3和Tn5中PAM1和MSN2的转录完全消失。单基因敲除株Δcmp2、Δimd4、Δssk2、Δppg1、Δpam1、Δdld3、Δmsn2均表现出乙醇耐受性，其中Δssk2、Δppg1、Δpam1在43°C下生长增强。在含30%葡萄糖和6%初始乙醇的培养基中，5个Tn突变株较对照生长更快、产乙醇更高
- 在42°C发酵中，Tn2和Tn3的最大乙醇浓度分别是对照的1.5倍和2.4倍。
研究结论
敲除或下调CMP2、IMD4、SSK2、PPG1、DLD3、PAM1和MSN2可增强酿酒酵母的乙醇耐受性，其中SSK2、PPG1和PAM1还参与热耐受。这些基因可作为改造工业酵母菌株的靶点，为提高乙醇生产效率提供基础。