Computational identification of gene over-expression targets for metabolic engineering of taxadiene production
- 作者
- Brett A. Boghigian, John Armando, Daniel Salas, Blaine A. Pfeifer
- 单位
- Tufts University
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2011）
- DOI
- 10.1007/s00253-011-3725-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过计算识别基因过表达靶点以提高大肠杆菌中异源紫杉二烯的产量
研究策略
基于基因组规模代谢模型iAF1260，结合通量平衡分析(FBA)和最小代谢调整(MoMA)建立过表达靶点识别算法；在甘油复合培养基条件下预测靶点，并在产紫杉二烯的大肠杆菌菌株中实验验证；进一步组合过表达限速基因idi与预测靶点。
核心内容
该研究基于大肠杆菌基因组规模代谢模型iAF1260，结合通量平衡分析与最小代谢调整算法，开发了一套计算识别基因过表达靶点的新方法，用于提高异源紫杉二烯的产量。在甘油复合培养基条件下，算法共预测出12个过表达靶点，其中8个位于MEP通路内，4个位于该通路之外。实验验证显示，过表达ppk、sthA和purN分别使紫杉二烯比产量提高1.66倍、1.48倍和1.31倍，而folD无显著影响。进一步研究发现idi是当前体系中的关键限速步骤，单独过表达可使比产量提升3.77倍。将idi与ppk、sthA、purN组合过表达后，比产量分别达到5.42、7.23和5.66 mg/g DCW，较已工程化对照菌株累计提高超过12倍。对照基因实验证实了预测的特异性。该研究首次系统性地将计算算法应用于过表达靶点识别而非传统的敲除靶点，并成功实验验证，表明该方法可推广至其他宿主和产物，为代谢工程中过表达策略的理性设计提供了有效工具。
创新点
开发了用于识别基因过表达靶点的计算算法（区别于传统敲除靶点）；系统评估了MEP通路内外靶点；实验验证了预测并发现IDI是当前条件下的限速步骤；组合过表达产生协同效应。
研究对象（21）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli YW22 (JM109(DE3)衍生) | 紫杉二烯合成途径 | txs | taxadiene synthase | 催化 | 异源表达的环化酶，催化GGPP生成taxa-4,11-diene |
| Escherichia coli YW22 (JM109(DE3)衍生) | 异戊二烯前体途径 | ggpps | geranylgeranyl diphosphate synthase | 催化 | 异源表达的香叶基香叶基二磷酸合酶，催化FPP+IPP→GGPP |
| Escherichia coli YW22 (JM109(DE3)衍生) | MEP途径 | idi | isopentenyl diphosphate isomerase | 催化 | 催化IPP与DMAPP异构化，实验证明为限速步骤 |
| Escherichia coli YW22 (JM109(DE3)衍生) | MEP途径 | dxs | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase | 催化 | MEP途径第一个酶，染色体中已过表达，额外过表达未提高产量 |
| Escherichia coli YW22 (JM109(DE3)衍生) | MEP途径 | dxr | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase | 催化 | 催化DXP→MEP，质粒无法稳定转化 |
| Escherichia coli YW22 (JM109(DE3)衍生) | MEP途径 | ispD | 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferase | 催化 | 染色体中已过表达，额外过表达未检测到紫杉二烯 |
| Escherichia coli YW22 (JM109(DE3)衍生) | MEP途径 | ispE | 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase | 催化 | 过表达降低产量 |
| Escherichia coli YW22 (JM109(DE3)衍生) | MEP途径 | ispF | 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase | 催化 | 染色体中已过表达，额外过表达降低产量 |
| Escherichia coli YW22 (JM109(DE3)衍生) | MEP途径 | ispG | 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate synthase | 催化 | 过表达降低产量 |
| Escherichia coli YW22 (JM109(DE3)衍生) | MEP途径 | ispH | 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase | 催化 | 过表达降低产量 |
| Escherichia coli YW22 (JM109(DE3)衍生) | MEP途径 | ispA | farnesyl diphosphate synthase | 催化 | 过表达降低产量 |
| Escherichia coli YW22 (JM109(DE3)衍生) | 多聚磷酸代谢 | ppk | polyphosphate kinase | 能量供给 | 算法预测靶点，催化ATP+Pi↔ADP+PPi，改善ATP可再生性，过表达提高1.66倍 |
| Escherichia coli YW22 (JM109(DE3)衍生) | 辅因子代谢 | sthA | soluble pyridine nucleotide transhydrogenase | 能量供给 | 算法预测靶点，催化NAD+ + NADPH ↔ NADH + NADP+，改善NADPH供应，过表达提高1.48倍 |
| Escherichia coli YW22 (JM109(DE3)衍生) | 四氢叶酸代谢 | purN | phosphoribosylglycinamide formyltransferase | 催化 | 算法预测靶点，过表达提高1.31倍，参与叶酸代谢 |
| Escherichia coli YW22 (JM109(DE3)衍生) | 四氢叶酸代谢 | folD | 5,10-methylene-tetrahydrofolate dehydrogenase/cyclohydrolase | 能量供给 | 算法预测靶点，产生NADPH，但实验未显著提高产量 |
| Escherichia coli YW22 (JM109(DE3)衍生) | TCA循环 | fumA | fumarase A | 催化 | 葡萄糖条件下的算法对照，过表达降低产量 |
| Escherichia coli YW22 (JM109(DE3)衍生) | TCA循环 | fumB | fumarase B | 催化 | 葡萄糖条件下的算法对照，过表达降低产量 |
| Escherichia coli YW22 (JM109(DE3)衍生) | TCA循环 | fumC | fumarase C | 催化 | 葡萄糖条件下的算法对照，过表达降低产量 |
| Escherichia coli YW22 (JM109(DE3)衍生) | TCA循环 | mdh | malate dehydrogenase | 催化 | 葡萄糖条件下的算法对照，过表达显著降低产量 |
| Escherichia coli YW22 (JM109(DE3)衍生) | TCA循环 | sucC | succinyl-CoA synthetase subunit beta | 催化 | 实验对照，对产量无显著影响 |
| Escherichia coli YW22 (JM109(DE3)衍生) | 辅因子代谢 | pntA | pyridine nucleotide transhydrogenase subunit alpha | 能量供给 | 实验对照，过表达使产量降低约一半 |
关键发现
- 算法识别出12个过表达靶点，其中4个位于异戊二烯前体通路外（ppk, sthA, purN, folD），8个位于MEP通路内
- 实验过表达ppk、sthA、purN分别使紫杉二烯比产量提高1.66倍、1.48倍、1.31倍（p<0.05），folD无显著影响
- 过表达idi使比产量提高3.77倍（p=0.008）
- 组合过表达idi与ppk、sthA、purN后，比产量分别达5.42、7.23、5.66 mg/g DCW，较已工程化对照菌株累计提高超过12倍
- 对照基因（fumA, fumB, fumC, mdh, sucC, pntA）均未提高产量，其中pntA使产量降低约一半
- 实验确定的YW22(pTrcHis2B-TXS-GGPPS)的紫杉二烯比生产速率为1.53×10^-4 mmol/g DCW/h。
研究结论
计算算法能够有效识别可提高紫杉二烯产量的过表达靶点，实验验证了预测趋势；IDI是当前体系中的关键限速步骤，将其与通路外靶点组合过表达可显著提高产量；该方法可推广到其他宿主和产物。