Deletion of lactate dehydrogenase in Enterobacter aerogenes to enhance 2,3-butanediol production
- 作者
- Moo-Young Jung, Chiam Yu Ng, Hyohak Song, Jinwon Lee, Min-Kyu Oh
- 单位
- Department of Chemical & Biological Engineering, Korea University, Seoul, Republic of Korea; Research and Development Center, GS Caltex Corporation, Daejeon, Republic of Korea; Department of Chemical & Biomolecular Engineering, Sogang University, Seoul, Republic of Korea
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2012）
- DOI
- 10.1007/s00253-012-3883-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
2,3-丁二醇是重要的生物基化学品，但产气肠杆菌发酵过程中会产生大量副产物乳酸，与2,3-丁二醇竞争丙酮酸和NADH，降低产量。
研究策略
利用λRed重组方法敲除产气肠杆菌中的乳酸脱氢酶基因ldhA，结合分批和补料发酵优化培养条件（添加酪蛋白氨基酸、提高通气量），提高2,3-丁二醇产量。
核心内容
本研究针对产气肠杆菌发酵生产2,3-丁二醇时乳酸副产物大量积累、竞争碳源和NADH的问题，利用λRed重组系统敲除乳酸脱氢酶基因ldhA，构建了突变株EMY-01，并通过分批及补料发酵优化培养条件提升目标产物产量。结果显示，敲除ldhA后乳酸产量从9.88 g/L降至0.34 g/L，降幅达97%；分批发酵中2,3-丁二醇产量由19.88 g/L升至23.2 g/L，生产力和产率分别提高16.3%和11.1%。补料发酵中突变株产量达69.12 g/L，较野生型提高28.5%，乳酸降低98.3%。进一步优化培养条件（添加10 g/L酪蛋白氨基酸、提高搅拌转速和通气量）后，54小时产量达到118.05 g/L，前34小时生产力达3.2 g/L/h，较出发菌株提高130%，生物量亦显著增加。此外，突变株在葡萄糖、木糖、甘油等六种碳源中的消耗速率和生物量均优于野生型。该研究证实敲除乳酸脱氢酶可有效消除碳代谢分流，结合发酵工艺优化能大幅提升2,3-丁二醇产量，为产气肠杆菌的代谢工程改造提供了有效策略。
创新点
首次在Enterobacter aerogenes中成功应用λRed重组方法敲除ldhA基因；通过敲除乳酸脱氢酶显著提高2,3-丁二醇产量，并获得了当时E. aerogenes报道的最高产量118.05 g/L。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Enterobacter aerogenes KCTC 2190 | 乳酸发酵途径 | ldhA | 乳酸脱氢酶 | 催化 | 敲除该基因以减少乳酸积累，使乳酸产量下降97% |
| Enterobacter aerogenes EMY-01 (ΔldhA) | 2,3-丁二醇合成途径 | — | — | — | 工程菌株，通过ldhA缺失提高2,3-丁二醇产量，在补料发酵中达到118.05 g/L |
| Enterobacter aerogenes KCTC 2190 | 基因敲除工具 | gam/exo/beta | λ Red重组酶 | 催化 | pKM208质粒表达的λ Red重组系统，用于同源重组敲除ldhA |
| Enterobacter aerogenes EMY-01 (ΔldhA) | 2,3-丁二醇合成途径 | — | — | — | 补料发酵中通过添加酪蛋白氨基酸和增加通气量提高生物量和产量 |
关键发现
- 敲除ldhA后，乳酸产量从9.88 g/L降至0.34 g/L（下降97%）
- 分批发酵中2,3-丁二醇产量从19.88 g/L提高到23.2 g/L（提高16.7%），2,3-丁二醇生产力和产率分别提高16.3%和11.1%
- 补料发酵中突变株2,3-丁二醇产量达69.12 g/L（比野生型提高28.5%），乳酸降低98.3%
- 优化培养条件（添加10 g/L酪蛋白氨基酸，搅拌转速从150 rpm增至280 rpm，通气量从1 vvm增至2 vvm）后，54小时产量达到118.05 g/L，前34小时生产力为3.2 g/L/h（提高130%），生物量提高124.8%。此外，在六种碳源（葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、木糖、甘油）中突变株的碳源消耗和生物量均提高。
研究结论
敲除乳酸脱氢酶基因能有效减少副产物乳酸，增加2,3-丁二醇产量，结合培养基和通气条件优化可获得最高产量，表明代谢工程是提高E. aerogenes生产2,3-丁二醇能力的有效手段。