L-Pantoyl lactone dehydrogenase from Rhodococcus erythropolis: genetic analyses and application to the stereospecific oxidation of L-pantoyl lactone
- 作者
- Dayong Si, Nobuyuki Urano, Shinya Nozaki, Kohsuke Honda, Sakayu Shimizu, Michihiko Kataoka
- 单位
- Division of Applied Life Sciences, Graduate School of Agriculture, Kyoto University, Kyoto, Japan; Division of Applied Life Sciences, Graduate School of Life and Environmental Sciences, Osaka Prefecture University, 1-1 Gakuencho, Naka-ku, Sakai, Osaka 599-8531, Japan; Faculty of Bioenvironmental Science, Kyoto Gakuen University, Kyoto, Japan
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2012）
- DOI
- 10.1007/s00253-012-3970-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
实现D-泛酰内酯生产中L-泛酰内酯的立体选择性氧化，并构建L-泛酰内酯到D-泛酰内酯的立体转化途径，克服传统外消旋拆分50%理论产率限制。
研究策略
从Rhodococcus erythropolis AKU2103中克隆L-泛酰内酯脱氢酶基因lpldh，构建含上游调控区的过表达载体pKPLDH并导入原始菌株提高酶活；通过基因敲除验证其功能；利用重组R. erythropolis细胞将L-PL氧化为KPL，再与表达KPA还原酶和葡萄糖脱氢酶的重组E. coli偶联，将自发水解产生的KPA不对称还原为D-PA，实现立体转化。
核心内容
该研究从红球菌Rhodococcus erythropolis AKU2103中克隆了L-泛酰内酯脱氢酶基因lpldh，全长1179 bp，编码392个氨基酸，属于FMN依赖性α-羟基酸脱氢酶家族。通过构建含上游调控区的过表达载体pKPLDH并导入原始菌株，重组菌在无诱导剂条件下LPLDH活性达42.4 mU/mg，诱导后升至59.2 mU/mg，较野生型诱导水平（9.6 mU/mg）提高约6倍。基因敲除实验证实该基因负责L-泛酰内酯氧化，且敲除株丧失利用1,2-丙二醇等为唯一碳源的能力。在细胞生物转化中，重组菌可将1.15 M L-泛酰内酯在184 h内氧化转化率达80.3%，而野生型仅12.6%。进一步将氧化产物自发水解后，与表达酮泛酸还原酶和葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌偶联，实现0.768 M L-泛酰内酯到0.707 M D-泛酰内酯的立体转化，产率92%。该工作突破了传统外消旋拆分50%的理论产率限制，为D-泛酸合成提供了具有工业潜力的替代路线。
创新点
['首次克隆微生物来源的L-泛酰内酯脱氢酶基因lpldh', '通过在R. erythropolis中过量表达含上游区的lpldh，无需诱导即获得高于野生型诱导水平的酶活', '实现高浓度（1.15 M）L-PL的立体选择性氧化，转化率达80%以上', '构建L-PL→KPL→KPA→D-PA三步偶联的立体转化工艺，从0.768 M L-PL获得0.707 M D-PL']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rhodococcus erythropolis AKU2103 | L-泛酰内酯氧化途径 | lpldh | LPLDH (L-泛酰内酯脱氢酶) | 催化 | 膜结合FMN依赖性酶，立体特异性氧化L-泛酰内酯为酮泛酰内酯 |
| Escherichia coli (pETSmKPR/pACGD) | 酮泛酸还原途径 | ketopantoic acid reductase gene (来自Stenotrophomonas maltophilia) | KPA还原酶 | 催化 | 将KPA不对称还原为D-泛解酸 |
| Escherichia coli (pETSmKPR/pACGD) | 葡萄糖代谢途径 | glucose dehydrogenase gene | 葡萄糖脱氢酶 | 能量供给 | 氧化葡萄糖再生NADPH，为KPA还原提供还原力 |
| Rhodococcus erythropolis AKU2103 | lpldh转录调控 | TetR homologous gene | TetR家族转录调控因子 | 调控 | 位于lpldh上游，推测参与lpldh的转录调控 |
关键发现
- lpldh基因全长1179 bp，编码392个氨基酸，属于FMN依赖性α-羟基酸脱氢酶/氧化酶家族
- 重组R. erythropolis AKU2103(pKPLDH)在无1,2-PD诱导时LPLDH活性为42.4 mU/mg，诱导后为59.2 mU/mg，而野生型诱导后仅9.6 mU/mg，活性提高约6倍
- 384 M L-PL在60 h内完全转化（>99.9%），0.768 M L-PL在144 h转化率达91.9%，1.15 M L-PL在184 h转化率达80.3%（细胞量0.36 g），而野生型在相同条件下仅12.6%
- 敲除lpldh后菌株丧失LPLDH活性且不能在1,2-PD、乙醇、1-丁醇或1-丙醇为唯一碳源时生长
- 偶联重组E. coli（pETSmKPR/pACGD）后，0.768 M L-PL经立体转化可得0.707 M D-PL，产率92%。
研究结论
成功克隆并表征了L-泛酰内酯脱氢酶基因lpldh，通过含上游区的过量表达显著提高R. erythropolis的LPLDH活性，并实现了L-PL到KPL的高效立体特异性氧化；与KPA还原酶系统偶联后完成了L-PL到D-PA的立体转化，为D-泛酸合成提供了有工业潜力的替代路线。