Characterization of the ginsenoside-transforming recombinant β-glucosidase from Actinosynnema mirum and bioconversion of major ginsenosides into minor ginsenosides
- 作者
- Chang-Hao Cui, Sun-Chang Kim, Wan-Taek Im
- 单位
- Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology; KAIST Institute for Biocentury, Korea Advanced Institute of Science and Technology
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2013）
- DOI
- 10.1007/s00253-012-4324-5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
高效生物转化主要人参皂苷（Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1）为具有更强药理活性的稀有人参皂苷，需要能特异性水解葡萄糖基的酶。现有酶制剂转化途径单一，缺乏能水解多种糖基的酶。
研究策略
从放线菌Actinosynnema mirum全基因组中克隆推定的β-葡萄糖苷酶基因bglAm，利用pGEX-4T-1载体在大肠杆菌BL21(DE3)中表达GST融合蛋白，经亲和纯化后表征酶学性质，并利用TLC和HPLC分析其转化多种人参皂苷的途径。
核心内容
本研究从放线菌Actinosynnema mirum基因组中克隆了推测的β-葡萄糖苷酶基因bglAm，并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了GST融合蛋白的异源表达与纯化。该酶属于糖苷水解酶家族3，最适pH为7.0，最适温度为37°C，以对硝基苯基葡萄糖苷为底物时Km为0.33 mM。酶学表征显示BglAm具有广泛的底物特异性和多样的水解途径，可选择性水解人参皂苷C3位和C20位的内外糖基。在转化实验中，该酶能将主要人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1转化为多种稀有人参皂苷，其中Rb1在1分钟内完全转化为Gyp XVII，经18小时后Gyp XVII消失，95小时后最终生成PPD。尤为重要的是，该研究首次报道了重组酶能够通过Gyp XVII→Rh2(S)→PPD途径实现Rb1到Rh2(S)的直接转化，打破了现有酶制剂转化途径单一的局限。这一发现为稀有人参皂苷的高效生物转化提供了新的酶工具，也拓展了家族3糖苷水解酶的功能多样性认识。
创新点
首次报道重组酶BglAm能将Rb1通过Gyp XVII和Rh2(S)转化为PPD的途径；BglAm能够选择性水解人参皂苷C3和C20位内外糖基，转化途径多样性优于已有糖苷水解酶；提供了家族3糖苷水解酶多样性的新信息。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Actinosynnema mirum KACC 20028T | 人参皂苷生物转化（水解） | bglAm | BglAm | 催化 | 来源于Actinosynnema mirum的β-葡萄糖苷酶，属于糖苷水解酶家族3，可水解人参皂苷C3和C20位葡萄糖 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源表达 | bglAm | GST-BglAm | 催化 | 重组蛋白在大肠杆菌中可溶表达，用于酶学表征和转化实验 |
关键发现
- bglAm基因长1830 bp，编码609个氨基酸，预测分子量65,277 Da。重组BglAm最适pH 7.0，最适温度37°C。以PNPGlc为底物时Km为0.33±0.01 mM，Vmax为5.94±0.06 μmol/min/mg蛋白。对Rb1转化为Gyp XVII的Km为0.69±0.06 mM，Vmax为16.13±0.29 μmol/min/mg蛋白
- 对Rd转化为F2的Km为0.45±0.02 mM，Vmax为51.56±1.35 μmol/min/mg蛋白。BglAm可转化Rb1通过Gyp XVII→Gyp LXXV→PPD及Gyp XVII→Rh2(S)→PPD
- Rb2→C-O→C-Y
- Rc→C-Mc1→C-Mc
- Rd→F2→Rh2(S)→PPD
- Rg3(S)→Rh2(S)→PPD
- Re→Rg2(S)
- Rg1→Rh1(S)→PPT。Rb1在1分钟内完全转化为Gyp XVII，18小时后Gyp XVII消失，95小时后最终转化为PPD。这是首次通过重组酶实现Rb1→Rh2的转化。
研究结论
BglAm是一种属于糖苷水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶，具有广泛的底物特异性和多种人参皂苷水解途径，能有效将主要人参皂苷转化为多种稀有人参皂苷，尤其是首次实现了Rb1到Rh2(S)的转化，为稀有人参皂苷的生产提供了新的酶工具。