Increase of betulinic acid production in Saccharomyces cerevisiae by balancing fatty acids and betulinic acid forming pathways
- 作者
- Jing Li, Yansheng Zhang
- 单位
- CAS Key Laboratory of Plant Germplasm Enhancement and Specialty Agriculture, Wuhan Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences; University of Chinese Academy of Sciences
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1007/s00253-013-5461-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在酿酒酵母中桦木酸产量低，其天然宿主含量极低，需要构建异源合成途径并优化代谢通量分配以提高桦木酸产量，同时避免细胞生长受抑制。
研究策略
在酿酒酵母中构建桦木酸生物合成途径，利用不同强度启动子（ADH1、GPD、TEF）调节桦木酸模块（HMG1、ERG9、CrAO）和脂肪酸模块（HFA1）的基因表达，构建9种通量分配组合菌株，考察两途径碳通量平衡对桦木酸产量和细胞生长的影响。
核心内容
通过在酿酒酵母中构建异源桦木酸合成途径并系统平衡脂肪酸合成与三萜合成两条途径的碳通量分配，该研究实现了桦木酸的高产且不影响细胞生长。作者利用不同强度的ADH1、GPD和TEF启动子分别调控桦木酸模块（HMG1、ERG9、CrAO）和脂肪酸模块（HFA1）的基因表达，构建了9种通量分配组合菌株。结果显示，各菌株桦木酸产量差异巨大，范围在0.01至1.92 mg L⁻¹ OD⁻¹之间。最优菌株WATM7-GT（GPD控制桦木酸模块、TEF控制脂肪酸模块）产量达1.92 mg L⁻¹ OD⁻¹，比最低产菌株高约39倍。碳源优化实验表明，1%葡萄糖加1%半乳糖的混合碳源可使产量比2%葡萄糖条件下提高约16倍。在桦木酸模块受ADH1或GPD控制时，降低脂肪酸模块表达可显著增加桦木酸产量。该研究证明通过精细化启动子组合平衡脂肪酸与三萜合成途径的碳通量，可以效提升异源三萜类化合物产量，这一策略具有推广价值。
创新点
系统性地平衡脂肪酸合成与三萜类（桦木酸）合成途径的碳通量，通过启动子强度组合实现代谢通量精细调控，在不影响生长表型的前提下显著提高桦木酸产量。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae WAT11 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | HMG1 | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 编码截短型tHMG1，为桦木酸途径限速酶，受不同启动子调控 |
| Saccharomyces cerevisiae WAT11 | 麦角固醇/三萜合成途径 | ERG9 | 法尼基二磷酸法尼基转移酶/角鲨烯合酶 | 催化 | 桦木酸模块成员，受不同启动子调控 |
| Saccharomyces cerevisiae WAT11 | 桦木酸合成途径 | CrAO | 香叶醇/羽扇醇单加氧酶（P450单加氧酶） | 催化 | 来自长春花，催化桦木酸形成，受不同启动子调控 |
| Saccharomyces cerevisiae WAT11 | 桦木酸合成途径 | LUS1 | 羽扇醇合酶 | 催化 | 来自拟南芥，由GAL1启动子诱导表达 |
| Saccharomyces cerevisiae WAT11 | 麦角固醇/三萜合成途径 | ERG1 | 角鲨烯单加氧酶 | 催化 | 由GAL10启动子诱导表达，增强向三萜方向通量 |
| Saccharomyces cerevisiae WAT11 | 麦角固醇合成途径 | ERG7 | 羊毛固醇合酶 | 催化 | 用MET3启动子替换天然启动子，通过甲硫氨酸抑制其表达以分流碳通量至桦木酸途径 |
| Saccharomyces cerevisiae WAT11 | 脂肪酸合成途径 | HFA1 | 乙酰辅酶A羧化酶 | 催化 | 脂肪酸模块关键基因，受不同启动子调控以改变脂肪酸合成通量 |
关键发现
- 构建的9株菌中桦木酸产量差异巨大，范围0.01–1.92 mg L−1 OD−1
- 最高产菌株WATM7-GT（GPD启动子控制桦木酸模块、TEF启动子控制脂肪酸模块）产量达1.92 mg L−1 OD−1，比最低产菌株WATM7-AA（0.049 mg L−1 OD−1）高约39倍
- 碳源优化实验表明，1%葡萄糖+1%半乳糖混合碳源下WAT4-G菌株桦木酸产量为0.24 mg L−1 OD−1，比2%葡萄糖（0.015 mg L−1 OD−1）高约16倍
- 不同启动子驱动CrAO时，ADH1启动子产量最高（0.41 mg L−1 OD−1），GPD为0.24 mg L−1 OD−1，TEF仅0.009 mg L−1 OD−1
- 当桦木酸模块受ADH1或GPD控制时，降低脂肪酸模块表达可使桦木酸产量增加，如WATM7-AA（0.049）到WATM7-AT（0.57），WATM7-GA（0.046）到WATM7-GT（1.92）。
研究结论
通过平衡脂肪酸合成与桦木酸合成途径的碳通量，可以在酿酒酵母中实现桦木酸高产且不损害细胞生长，该代谢工程策略可推广到其他三萜类化合物的合成。