Enhanced C30 carotenoid production in Bacillus subtilis by systematic overexpression of MEP pathway genes
- 作者
- Dan Xue, Ingy I. Abdallah, Ilse E. M. de Haan, Mark J. J. B. Sibbald, Wim J. Quax
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/s00253-015-6531-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过系统过表达MEP途径基因提高枯草芽孢杆菌中类异戊二烯（以C30类胡萝卜素为报告产物）的产量，并解析MEP途径各酶对代谢通量的控制作用。
研究策略
将MEP途径基因分为A组（dxs、ispD、ispF、ispH）和B组（ispC、ispE、ispG、ispA），逐步构建包含不同基因组合的合成操纵子并过表达，以C30类胡萝卜素产量作为通量读数，系统分析各酶对通量的贡献。
核心内容
该研究以枯草芽孢杆菌168为宿主，以C30类胡萝卜素为报告产物，系统考察了MEP途径八个基因过表达对类异戊二烯通量的影响。作者将MEP途径基因分为A组（dxs、ispD、ispF、ispH）和B组（ispC、ispE、ispG、ispA），基于θ复制质粒pHCMC04G构建了一系列含不同基因组合的合成操纵子并逐步过表达，以各菌株类胡萝卜素产量作为通量读数。结果显示，对照菌株产量为0.60 mg/g dcw；A组中逐步叠加dxs、ispD、ispF、ispH使产量升至9.03 mg/g dcw（15.1倍）；B组中单独过表达ispC即可达5.54 mg/g dcw（9.2倍），首次证明该基因在枯草芽孢杆菌中的有效性，随后叠加ispE、ispG、ispA，最终p04CEGA组合产量最高，达10.65 mg/g dcw，为对照的17.8倍。该工作系统解析了MEP途径各酶对通量的贡献，证明该途径是类异戊二烯合成的关键限速环节，为在GRAS宿主中构建类异戊二烯细胞工厂提供了基础。
创新点
首次系统研究枯草芽孢杆菌MEP途径几乎所有基因过表达对类异戊二烯产量的影响；发现ispC过表达能显著提高产量（9.2倍），此前未被报道；构建了基于θ复制质粒pHCMC04G的稳定合成操纵子表达系统。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus subtilis 168 | MEP途径 | dxs | Dxs | 催化 | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶 |
| Bacillus subtilis 168 | MEP途径 | ispC | Dxr (IspC) | 催化 | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 |
| Bacillus subtilis 168 | MEP途径 | ispD | IspD | 催化 | 2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胞苷酰转移酶 |
| Bacillus subtilis 168 | MEP途径 | ispE | IspE | 催化 | 4-(胞苷5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶 |
| Bacillus subtilis 168 | MEP途径 | ispF | IspF | 催化 | 2-C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸合酶 |
| Bacillus subtilis 168 | MEP途径 | ispG | IspG | 催化 | (E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸合酶 |
| Bacillus subtilis 168 | MEP途径 | ispH | IspH | 催化 | 4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶 |
| Bacillus subtilis 168 | 类异戊二烯前体合成 | ispA | IspA | 催化 | 法尼基二磷酸合酶，催化IPP/DMAPP缩合生成GPP/FPP |
| Bacillus subtilis 168 | C30类胡萝卜素合成 | crtM | CrtM | 催化 | 来自金黄色葡萄球菌，4,4'-脱氢角鲨烯合酶（C30类胡萝卜素合成） |
| Bacillus subtilis 168 | C30类胡萝卜素合成 | crtN | CrtN | 催化 | 来自金黄色葡萄球菌，4,4'-脱氢角鲨烯脱饱和酶（C30类胡萝卜素合成） |
关键发现
- 过表达MEP途径基因可显著提高枯草芽孢杆菌的C30类胡萝卜素产量。对照菌株（仅含pHYcrtMN）总类胡萝卜素产量为0.60 mg/g dcw
- 过表达dxs（p04S）产量为4.81 mg/g dcw（8.0倍）
- p04SD（dxs+ispD）为5.27 mg/g dcw（8.8倍）
- p04SDF（dxs+ispD+ispF）为6.83 mg/g dcw（11.4倍）
- p04SDFH（dxs+ispD+ispF+ispH）为9.03 mg/g dcw（15.1倍）
- p04C（ispC）为5.54 mg/g dcw（9.2倍），首次证明ispC过表达有效
- p04CE（ispC+ispE）为7.62 mg/g dcw（12.7倍）
- p04CEG（ispC+ispE+ispG）为7.84 mg/g dcw（13.1倍）
- p04CEGA（ispC+ispE+ispG+ispA）产量最高，达10.65 mg/g dcw（17.8倍）。各菌株总类胡萝卜素产量标准差较低，重复性良好。
研究结论
系统过表达MEP途径基因能有效提高枯草芽孢杆菌的类异戊二烯前体供应，显著增加C30类胡萝卜素产量，最高达10.65 mg/g dcw（17.8倍）。该研究为构建基于GRAS宿主枯草芽孢杆菌的类异戊二烯细胞工厂奠定了基础。