Metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae for enhanced isoamyl alcohol production
- 作者
- Jifeng Yuan, Xue Chen, Pranjul Mishra, Chi-Bun Ching
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/s00253-016-7970-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解决酿酒酵母中异戊醇产量低、副产物（异丁醇和2-甲基-1-丁醇）大量生成的问题，通过重建亮氨酸生物合成途径耦合Ehrlich降解途径并结合线粒体区室化与转运蛋白工程，实现异戊醇的高效生产。
研究策略
采用两种策略：(1) 利用δ整合平台在染色体上组装亮氨酸生物合成途径（ILV2、ILV5、ILV3、LEU9、LEU1、LEU2），由半乳糖诱导型强启动子驱动；(2) 过表达线粒体α-异丙基苹果酸（α-IPM）转运蛋白OAC1，增强α-IPM从线粒体到胞质的转运。下游Ehrlich降解途径（ARO10和ADH7）通过质粒表达。
核心内容
本研究以酿酒酵母BY4741为底盘，针对异戊醇产量低且异丁醇、2-甲基-1-丁醇等副产物大量积累的问题，通过代谢工程策略重建亮氨酸生物合成途径并耦合Ehrlich降解途径。首先利用δ整合平台在染色体上组装由半乳糖诱导型启动子驱动的ILV2、ILV5、ILV3、LEU9、LEU1、LEU2六个基因，并通过质粒表达ARO10和ADH7完成下游降解；随后过表达线粒体α-异丙基苹果酸转运蛋白OAC1，增强α-IPM从线粒体到胞质的转运，形成推拉策略。最优菌株MC5b在摇管条件下异戊醇产量达561.21 mg/L，较仅表达ARO10/ADH7的参考菌株支链醇产量不足20 mg/L提升超过78倍，同时异丁醇降至321.64 mg/L，2-甲基-1-丁醇降至160.82 mg/L；OAC1过表达使异戊醇额外增加19.9%–34.4%，异丁醇降低11.9%–39.5%，最佳异戊醇转化率达14.18 mg/g糖，为先前报道的2倍。结果表明，利用天然线粒体区室化屏障结合转运蛋白工程可有效减少副产物形成并提高目标产物产量，为后续菌株优化提供了可行策略。
创新点
首次构建染色体整合的亮氨酸生物合成途径用于异戊醇生产；利用线粒体区室化作为屏障减少副产物形成，结合OAC1转运蛋白工程实现推拉策略，有效提高异戊醇产量并降低异丁醇副产物。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 亮氨酸生物合成途径 | ILV2 | 乙酰乳酸合酶 | 催化 | 染色体整合，受半乳糖诱导型启动子控制，催化丙酮酸生成乙酰乳酸 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 亮氨酸生物合成途径 | ILV5 | 酮醇酸还原异构酶 | 催化 | 染色体整合，受半乳糖诱导型启动子控制，催化乙酰乳酸还原异构 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 亮氨酸生物合成途径 | ILV3 | 二羟基酸脱水酶 | 催化 | 染色体整合，受半乳糖诱导型启动子控制，催化二羟基酸脱水 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 亮氨酸生物合成途径 | LEU9 | α-异丙基苹果酸合酶 | 催化 | 选择LEU9因其抗反馈抑制，染色体整合，催化α-IPM合成 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 亮氨酸生物合成途径 | LEU1 | 异丙基苹果酸异构酶 | 催化 | 染色体整合，催化α-IPM异构为β-IPM |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 亮氨酸生物合成途径 | LEU2 | β-异丙基苹果酸脱氢酶 | 催化 | 染色体整合，催化β-IPM氧化脱羧生成α-酮异己酸(KIC) |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | Ehrlich降解途径 | ARO10 | α-酮酸脱羧酶 | 催化 | 质粒pRS426-ARO10/ADH7表达，催化KIC脱羧为异戊醛 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | Ehrlich降解途径 | ADH7 | 醇脱氢酶 | 催化 | 质粒pRS426-ARO10/ADH7表达，催化异戊醛还原为异戊醇 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 线粒体转运/亮氨酸生物合成途径 | OAC1 | 线粒体α-异丙基苹果酸转运蛋白 | 转运 | 质粒pRS413-OAC1过表达，增强α-IPM从线粒体输出至胞质，同时作为草酰乙酸反向转运体 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 线粒体转运 | MPC1-2/3 | 线粒体丙酮酸载体 | 转运 | 背景提及，负责丙酮酸进入线粒体，未直接工程操作 |
关键发现
最优菌株MC5a（染色体整合亮氨酸途径+质粒表达ARO10/ADH7）在摇管条件下异戊醇产量达467.83 mg/L，同时异丁醇438.59 mg/L、2-甲基-1-丁醇181.70 mg/L。进一步过表达OAC1后，MC5b菌株异戊醇产量提高至561.21 mg/L，异丁醇降至321.64 mg/L，2-甲基-1-丁醇降至160.82 mg/L，相比仅表达ARO10/ADH7的BY4741参考菌株（<20 mg/L支链醇），异戊醇提升超过78倍。OAC1过表达使异戊醇产量额外增加19.9%-34.4%，异丁醇降低约11.9%-39.5%。最佳异戊醇转化率达14.18 mg/g糖，为先前报道的2倍。
研究结论
本研究首次在酿酒酵母中构建染色体整合的亮氨酸生物合成途径用于异戊醇生产，证明利用天然线粒体区室化结合OAC1转运蛋白工程是减少副产物、提高异戊醇产量的有效策略，为后续代谢工程优化奠定了基础。