Pathway engineering for the production of β-amyrin and cycloartenol in Escherichia coli—a method to biosynthesis plant-derived triterpene skeletons in E. coli
- 作者
- Miho Takemura, Rie Tanaka, Norihiko Misawa
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/s00253-017-8409-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
环状三萜（如环阿屯醇和β-香树脂醇）被认为是无法在大肠杆菌中产生的，此前也没有在大肠杆菌中生产这类化合物的报道，尽管它们具有重要的工业价值。
研究策略
构建大肠杆菌异源生物合成途径：将来自拟南芥的鲨烯合酶（AtSQS）、鲨烯环氧酶（AtSQE）与环阿屯醇合酶（AtCAS1）或来自金刚纂的β-香树脂醇合酶（EtAS）基因导入大肠杆菌，并引入雨生红球藻的IPP异构酶基因（HpID1）以增加FPP供应；同时优化基因排列顺序，并共表达NADPH再生基因和氧化还原伴侣蛋白基因以增强产物合成。
核心内容
本研究在大肠杆菌中实现了植物源环状三萜环阿屯醇和β-香树脂醇的从头生物合成。通过引入拟南芥鲨烯合酶、鲨烯环氧酶及环阿屯醇合酶或金刚纂β-香树脂醇合酶，并共表达雨生红球藻IPP异构酶以增强FPP供应，成功构建了完整代谢途径。质谱鉴定证实两种产物与标准品一致，且未检测到中间体2,3-氧化鲨烯，表明其被迅速转化。关键发现是基因排列顺序对功能表达至关重要，仅当HpID1-AtSQS-AtSQE顺序排列时才可产生产物。研究还首次证明植物源鲨烯环氧酶在大肠杆菌中无需辅因子即可独立发挥作用。单独表达NADPH再生酶或氧化还原伴侣蛋白对产量无明显影响，但二者共表达可使三萜产量提高数倍，且不同来源的伴侣蛋白与鲨烯环氧酶的匹配性显著影响产量。该体系为植物源氧化鲨烯环化酶基因功能分析提供了便捷平台，也为利用大肠杆菌生产药用植物来源的功能性三萜类化合物奠定了基础。
创新点
['首次证明植物来源的鲨烯环氧酶（AtSQE）在大肠杆菌中无需额外辅因子即可发挥功能，改变了此前认为SQE需要氧化还原伴侣蛋白才能工作的观点。', '首次实现了大肠杆菌中植物源环状三萜环阿屯醇和β-香树脂醇的从头生物合成。', '发现基因排列顺序（HpID1-AtSQS-AtSQE）对功能表达至关重要。', '证实共表达特定氧化还原伴侣蛋白（CamAB或NsRED/NsFER）与NADPH再生酶（Zwf或Gdh）可提高三萜产量数倍。']
研究对象（14）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 三萜生物合成 | HpID1 | IPP isomerase (idi) | 催化 | 来自雨生红球藻，催化IPP与DMAPP异构化，增强FPP前体供应 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 三萜生物合成 | AtSQS | squalene synthase | 催化 | 来自拟南芥，催化两分子FPP缩合生成鲨烯 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 三萜生物合成 | AtSQE | squalene epoxidase | 催化 | 来自拟南芥，催化鲨烯环氧化为2,3-氧化鲨烯 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 三萜生物合成 | AtCAS1 | cycloartenol synthase | 催化 | 来自拟南芥，催化2,3-氧化鲨烯环化为环阿屯醇 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 三萜生物合成 | EtAS | β-amyrin synthase | 催化 | 来自金刚纂（Euphorbia tirucalli），催化2,3-氧化鲨烯环化为β-香树脂醇 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | NADPH再生 | zwf | glucose 6-phosphate dehydrogenase | 能量供给 | 来自大肠杆菌，催化葡萄糖-6-磷酸脱氢产生NADPH |
| Escherichia coli BL21(DE3) | NADPH再生 | gdh | glucose dehydrogenase | 能量供给 | 来自枯草芽孢杆菌，催化葡萄糖脱氢产生NADPH |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 电子传递 | camA | putidaredoxin reductase | 能量供给 | 来自恶臭假单胞菌，与camB组成氧化还原伴侣系统，为AtSQE提供电子 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 电子传递 | camB | putidaredoxin | 能量供给 | 来自恶臭假单胞菌，铁氧还蛋白，参与电子传递 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 电子传递 | NsRED | ferredoxin reductase | 能量供给 | 来自鱼腥藻PCC7120，与NsFER组成氧化还原伴侣系统 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 电子传递 | NsFER | ferredoxin | 能量供给 | 来自鱼腥藻PCC7120，铁氧还蛋白，参与电子传递 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 电子传递 | SoFNR | ferredoxin reductase (FNR) | 能量供给 | 来自菠菜，测试的电子传递蛋白，但未提高三萜产量 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 电子传递 | SoFER | ferredoxin I | 能量供给 | 来自菠菜，与SoFNR组成伴侣系统，但未显示促进作用 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 电子传递 | AtATR2 | NADPH-P450 reductase 2 | 能量供给 | 来自拟南芥，作为氧化还原伴侣蛋白比较，未提高产量 |
关键发现
- ['成功在大肠杆菌中生产出环阿屯醇（GC保留时间22.7 min）和β-香树脂醇（GC保留时间22.0 min），经质谱鉴定与标准品一致。', '未检测到中间产物2,3-氧化鲨烯，推测其不稳定并迅速被OSC转化为环状三萜。', '基因顺序为HpIDI、AtSQS、AtSQE时（pAC-HpIDI/AtSQS/SQE）才能实现环阿屯醇或β-香树脂醇的生产
- 顺序颠倒（pAC-HpIDI/AtSQE/SQS）则无法产生环阿屯醇。', '单独引入NADPH再生酶（gdh或zwf）或氧化还原伴侣蛋白（camAB、NsRED/NsFER）对产物产量无明显影响，但共表达NADPH再生酶与特定伴侣蛋白（gdh+CamAB、gdh+NsRED/NsFER、zwf+CamAB、zwf+NsRED/NsFER）可使三萜产量提高数倍（several fold）。', '菠菜的SoFNR/SoFER和拟南芥的AtATR2无论是单独还是与NADPH再生酶共表达，均未提高产量，表明SQE与电子传递蛋白的相容性至关重要。']
研究结论
本研究首次证明植物源鲨烯环氧酶（AtSQE）在大肠杆菌中能独立发挥功能，并成功建立了在大肠杆菌中从FPP合成环阿屯醇和β-香树脂醇这两种重要环状三萜骨架的方法。通过优化基因顺序以及共表达NADPH再生酶和特定氧化还原伴侣蛋白，可有效提高三萜产量。该体系不仅为植物源氧化鲨烯环化酶（OSC）基因的功能分析提供了便利平台，也为最终利用大肠杆菌生产源自药用植物的功能性三萜类化合物奠定了基础。