CYP109E1 is a novel versatile statin and terpene oxidase from Bacillus megaterium
- 作者
- Natalia Putkaradze, Martin Litzenburger, Ammar Abdulmuhni, Mohammed Milhim, Elisa Brill, Frank Hannemann, Rita Bernhardt
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/s00253-017-8552-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
全面表征新的细胞色素P450酶CYP109E1的底物谱，探索其催化他汀类（他汀前体compactin、前药lovastatin和simvastatin）及多种萜烯类化合物的氧官能化能力，特别是工业上重要的pravastatin生产。
研究策略
通过聚焦化合物文库筛选结合差谱光谱测定底物结合与解离常数；利用重组CYP109E1与牛肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶(AdR)和铁氧还蛋白(Adx4-108)构成体外重构系统验证活性；构建B. megaterium MS941全细胞转化体系放大生产，并通过NMR鉴定产物结构；最后用分子对接解析区域选择性的结构基础。
核心内容
本研究系统表征了来自巨大芽孢杆菌的新型细胞色素P450酶CYP109E1的底物谱与催化功能。通过聚焦化合物文库筛选和差谱光谱分析，测得该酶对辛伐他汀结合亲和力最强（Kd=4.7 μM），对洛伐他汀和康帕丁的Kd分别为9.6 μM和84 μM。体外重构系统中，该酶可在15分钟内转化多种底物，其中β-紫罗酮转化率达96%，辛伐他汀72%，洛伐他汀63%。首次发现CYP109E1可将康帕丁直接羟化为普伐他汀，并新报道了其环氧酶活性，鉴定出包括新化合物2-羟基-β-大马酮在内的多种氧化产物。利用巨大芽孢杆菌MS941构建的全细胞催化体系在4小时内产普伐他汀14 mg/L，优于已报道的P450sca-2和CYP107DY1体系。分子对接解析了区域选择性的结构基础。该酶兼具他汀类羟化与萜烯羟化/环氧化的多功能性，为普伐他汀及多种高价值萜烯衍生物的绿色生物合成提供了具有工业化潜力的新催化剂。
创新点
首次发现CYP109E1能将compactin直接羟化为pravastatin；首次报道CYP109E1的环氧酶活性；发现并鉴定了一个新化合物2-羟基-β-大马酮；实现了对simvastatin C4"位的新型羟基化；建立了高产率、高选择性的全细胞催化体系。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus megaterium MS941 | 细胞色素P450全细胞生物转化 | CYP109E1 | CYP109E1 | 催化 | 全细胞转化宿主，异源表达CYP109E1实现他汀和萜烯的生物转化 |
| Escherichia coli C43(DE3) | 蛋白表达 | CYP109E1 | CYP109E1 | 催化 | 用于CYP109E1的异源表达和纯化 |
| — | P450电子传递链 | — | AdR (bovine adrenodoxin reductase) | 能量供给 | 体外重构系统中的NADPH依赖性电子供体 |
| — | P450电子传递链 | — | Adx4-108 (truncated bovine adrenodoxin) | 能量供给 | 体外重构系统中介导电子从AdR传递至CYP109E1 |
关键发现
- CYP109E1对simvastatin结合最强（Kd=4.7±1.8 μM），对compactin的Kd=84±13 μM，对lovastatin的Kd=9.6±3.5 μM
- 体外15 min内，compactin转化率11%，lovastatin 63%，simvastatin 72%，α-ionone 95%，β-ionone 96%，nootkatone 70%，isolongifolen-9-one 91%，α-damascone 72%，β-damascone 70%，β-damascenone 70%
- 全细胞体系4小时产生pravastatin达14 mg/L，优于已报道的P450sca-2（12.9 mg/L/21h）和CYP107DY1（13.2 mg/L/20h）体系
- 产物包括6'β-羟基-lovastatin、3'α-羟基-simvastatin、4"-羟基-simvastatin、3-羟基-α-紫罗酮、4-羟基-β-紫罗酮、11,12-环氧-nootkatone、4(R)-羟基-isolongifolen-9-one、3-羟基-α-大马酮、4-羟基-β-大马酮、3,4-环氧-β-大马酮及新化合物2-羟基-β-大马酮。
研究结论
CYP109E1是一种新型多功能、高区域选择性的他汀类羟化酶和萜烯羟化酶/环氧酶，可用于生产pravastatin、人体他汀代谢物及多种有价值的萜烯衍生物，其全细胞体系具有工业化应用潜力。